植物miRNA基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建及intronic miRNA分析.pdf

1、MicroRNAs(miRNA)是一類長約21～24nt的小分子RNA。miRNA具有重要的調(diào)控基因表達(dá)功能，可降解靶基因的mRNA或抑制蛋白質(zhì)的翻譯。但目前對于miRNA基因本身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控知之甚少。由此，我們通過系統(tǒng)分析植物miRNA在基因組上的分布結(jié)構(gòu)、pri-miRNA、miRNA啟動子、調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄因子等各方面的信息，建立了植物miRNA基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫pmiRGD(plant miRNA Genomics Databas

2、e)，以期為深入理解MIRNA基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控機(jī)制提供全方位信息支持。
　　 Intronic miRNA位于其它轉(zhuǎn)錄單元(宿主基因)的內(nèi)含子內(nèi)，與靶基因、宿主基因之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。而植物intronicmiRNA的研究卻非常少。我們以模式植物擬南芥、水稻為例，系統(tǒng)分析了植物intronic miRNA的特征、表達(dá)特性和功能。這些信息將推進(jìn)植物intronic miRNA的研究。
　　 本研究的主要結(jié)果如下：

3、r>　　 (一)miRNA基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫pmiRGD的構(gòu)建
　　 (1)miRNA前體序列和基因組序列的獲?。?8種植物的9299個miRNA前體序列來自miRBase、PMRD數(shù)據(jù)庫，以及近期的文獻(xiàn)；相應(yīng)植物的基因組注釋信息來自TAIR10、RGAP6.1、及phytozome6.0等植物基因組數(shù)據(jù)庫。
　　 (2)miRNA與其他轉(zhuǎn)錄單元的位置關(guān)系分析：利用BLASTN將pre-miRNA完全匹配到基因組，及相關(guān)注

4、釋基因或內(nèi)含子內(nèi)上，尋找miRNA的宿主基因。共有7255個pre-migNA完全匹配到基因組上7940個互不重疊的位置及相應(yīng)的宿主基因，其中約10％的miRNA定位于其它轉(zhuǎn)錄基因的內(nèi)含子內(nèi)。
　　 (3)miRNA簇：位于同一宿主基因有義鏈上的miRNA為同一基因簇，67個基因內(nèi)miRNA位于32個miRNA簇；其它位于基因組的同一條鏈上，分別以1kb、2kb、3kb為最大間隔距離(MID)確定為同一基因簇，724個基因間mi

5、RNA位于318個miRNA簇(MID=3kb)。
　　 (4)pri-miRNA：通過廣泛的文獻(xiàn)檢索，共獲得擬南芥、玉米中，127個MIRNA基因的328個RACE驗(yàn)證的pri-miRNA。此外，BLASTN結(jié)果中，969個miRNA分布于941個宿主基因的有意義鏈上，這些宿主基因的mRNA也作為相應(yīng)miRNA的原初轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)。
　　 (5)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)確定及啟動子序列獲得：根據(jù)pri-miRNA確定

6、miRNA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)。獲取TSS上游最長1kb范圍內(nèi)的基因間序列作為啟動子。對其它未確定TSS的miRNA，獲取pre-miRNA上游最長2kb范圍內(nèi)的基因間序列作為啟動子。
　　 (6)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)鑒定：利用P-Match和TF-scan兩個程序分析miRNA啟動子區(qū)域內(nèi)可能的TFBS。P-Match利用TRANSFAC6.0植物啟動子元件數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)進(jìn)行預(yù)測；TF-scan利用Mcgraw等

7、人構(gòu)建的99個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列的矩陣進(jìn)行預(yù)測。在miRNA的啟動子上發(fā)現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 (7)miRNA的表達(dá)模式分析：利用植物小RNA高通量測序的數(shù)據(jù)，分析miRNA在不同發(fā)育階段、不同組織的表達(dá)模式。目前pmiRGD僅提供水稻和擬南芥miRNA在根、地上部、花中的表達(dá)模式。
　　 PmiRGD數(shù)據(jù)庫網(wǎng)頁使用Microsoft Visual Studio 2008編寫，Access 2003數(shù)據(jù)庫

8、存儲數(shù)據(jù)，系統(tǒng)運(yùn)行在Windows 2003服務(wù)器。網(wǎng)頁設(shè)計(jì)簡潔易用，免費(fèi)對用戶開放，網(wǎng)址：www.plantmirgo.org。
　　 (二)擬南芥、水稻intronic miRNA特征分析
　　 (1)從已有的數(shù)據(jù)庫(miRBase v18、PMRD v1.0)和文獻(xiàn)中，共獲得1495(擬南芥)和2760(水稻)個pre-miRNA序列。利用BLASTN發(fā)現(xiàn)了37個擬南芥和181個水稻intonic miRNA位于蛋

9、白編碼基因的內(nèi)含子。分別選取16個(擬南芥)和10個(水稻)intronic miRNA進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，證明了這些miRNA來源于真正的內(nèi)含子。
　　 (2)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥2個intronic miRNA位于同一個基因簇；水稻13個intronic miRNA分別位于6個miRNA簇。這些位于同一基因簇的miRNA大多來自不同的基因家族，暗示它們可以作用于不同的靶基因。同時，染色體定位分析表明，擬南芥73％(27

10、/37)，和水稻55％(99/181)的intronic miRNA定位于基因組片段復(fù)制區(qū)域，這暗示了基因組或染色體的片段復(fù)制事件可能對于intronic miRNA的起源和進(jìn)化起到了非常重要的作用。
　　 (3)含有miRNA的內(nèi)含子長度分析結(jié)果顯示，擬南芥79.2％的的內(nèi)含子小于1kb(最大3298bp)。91.7％的pre-miRNA上游序列小于1kb。水稻83％的內(nèi)含子小于3kb(最長12626bp)，71.4％的上游區(qū)

11、域小于1kb。這些數(shù)據(jù)說明植物的內(nèi)含子比較小。取內(nèi)含子范圍內(nèi)miRNA的上游序列進(jìn)行啟動子預(yù)測，擬南芥1個(1/37)、水稻14個(14/181)內(nèi)含子預(yù)測到有啟動子存在。由此可見，植物中較小的內(nèi)含子和少數(shù)可能的啟動子，暗示大多數(shù)intronicmiRNA在宿主基因內(nèi)部不存在獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位。
　　 (4)經(jīng)MPSS數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥的19個、水稻的48個intronic miRNA檢測到了表達(dá)，這說明intronic miR

12、NA是真實(shí)表達(dá)的。利用Genevestigator數(shù)據(jù)庫，分析宿主基因在植物不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，大多數(shù)基因在幾乎所有的發(fā)育時期都表達(dá)，且有較高的表達(dá)水平。另外，發(fā)現(xiàn)了擬南芥1個基因、水稻26個基因只在植物發(fā)育的某一個或兩個階段特異表達(dá)。宿主基因的這些表達(dá)特性，暗示了與其共表達(dá)的intronic miRNA在植物生長發(fā)育過程中重要作用。
　　 (5)利用降解組測序數(shù)據(jù)，鑒定了擬南芥13個成熟體intronic miR