miRNA589在TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用及分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：腹膜透析是終未期腎病重要的腎臟替代治療方式之一，透析相關(guān)性腹膜纖維化導(dǎo)致的超濾衰竭已成為影響腹膜透析療效，繼而影響其預(yù)后的主要原因。腹膜間皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)是啟動(dòng)和維持腹膜纖維化的關(guān)鍵機(jī)制，TGF-β1在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　 microRNA(miRNA，miR)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組非編碼小RNA，通過(guò)特異性識(shí)別下游靶基因mRNA的3

2、’非翻譯區(qū)(UTR)抑制其翻譯，或直接降解mRNA，在多種生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。新近關(guān)于乳腺癌、糖尿病腎病的研究表明，miRNA是參與調(diào)控EMT的重要因素之一，可能與其影響轉(zhuǎn)錄因子及參與調(diào)節(jié)TGF-β1下游信號(hào)通路等機(jī)制有關(guān)。但在腹膜纖維化領(lǐng)域尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 我們前期的研究首次發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期腹膜透析患者(>12個(gè)月)腹透液脫落細(xì)胞中miRNA194表達(dá)明顯上調(diào)，且與E-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與α-SMA表達(dá)呈正相

3、關(guān)，提示miRNA194與腹膜間皮細(xì)胞EMT有一定相關(guān)性。但發(fā)生EMT時(shí)腹膜間皮細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜改變及miRNA參與EMT調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。
　　 基于以上分析，我們認(rèn)為經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)發(fā)生EMT的腹膜間皮細(xì)胞可出現(xiàn)miRNA表達(dá)譜的特征性改變，調(diào)節(jié)特定miRNA的表達(dá)水平可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞EMT。
　　 第一章 TGF-β1誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT及miRNA表達(dá)圖譜分析
　　 目

4、的：分析經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)發(fā)生EMT的腹膜間皮細(xì)胞miRNA表達(dá)圖譜，篩查可能介導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞EMT的miRNA。
　　 方法：常規(guī)培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞，分對(duì)照組、TGF-β1刺激12h、24h、48h組。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用免疫熒光、Realtime PCR檢測(cè)ZO-1、vimentin的表達(dá)，采用Realtime PCR、Westernblot檢測(cè)E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)。應(yīng)用基因芯片法篩查對(duì)

5、照組和TGF-β1刺激48h組腹膜間皮細(xì)胞miRNA表達(dá)圖譜并進(jìn)行差異分析。應(yīng)用軟件預(yù)測(cè)miRNA下游靶基因，篩查可能參與介導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞EMT的miRNA，并以Realtime PCR驗(yàn)證目的miRNA在對(duì)照組和TGF-β1刺激24h組腹膜間皮細(xì)胞的表達(dá)，分別計(jì)算2-△△CT值。
　　 結(jié)果： TGF-β1誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣改變，TGF-β1刺激后腹膜間皮細(xì)胞ZO-1、E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，vim

6、entin表達(dá)明顯上調(diào)，呈時(shí)間依賴(lài)性，與對(duì)照組比較有顯著性差異，TGF-β1成功誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT。基因芯片法篩查發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)48h后腹膜間皮細(xì)胞miRNA表達(dá)圖譜出現(xiàn)特征性改變，hsa-miRPlus-E1114、hsa-miRPlus-E1245表達(dá)上調(diào)，hsa-miR-589、hsa-miR-505*、has-miRPlus-F1147、hsa-miRPlus-E1033、hsa-miR-337-5p、hsa-mi

7、R-513a-5p、hsa-miRPlus-E1075、hsa-miR-891a、hsa-miR-1260、hsa-miR-1280、hsa-let-7e、hsa-miR-1255a表達(dá)下調(diào)。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)靶基因，miR-589、miR-1260下游靶基因中均包括Ets-1(E-cadherin抑制轉(zhuǎn)錄子SIP1的上游調(diào)節(jié)因子)。選擇miRNA589為研究對(duì)象，Realtime PCR結(jié)果提示，設(shè)對(duì)照組2-△△CT值為1，TGF-β1刺激2

8、4h組miRNA589的2-△△CT值為0.6992±0.0924(p<0.01)。
　　 結(jié)論： TGF-β1可成功誘導(dǎo)腹膜問(wèn)皮細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)miRNA表達(dá)圖譜發(fā)生特征性改變。分析各miRNA表達(dá)量及預(yù)測(cè)下游靶基因，其中miR-589可能參與TGF-β1誘導(dǎo)的EMT調(diào)控。
　　 第二章 miRNA-589介導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制
　　 目的：探討miRNA589對(duì)體外人腹膜間皮細(xì)胞株

9、(HPMC)EMT的影響及分子機(jī)制。
　　 方法：常規(guī)培養(yǎng)HPMC細(xì)胞，分為對(duì)照組(無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng))、TGF-β1組(TGF-β15ng/ml誘導(dǎo)24h)、TGF-β1+pre-miR-589組(pre-miR-589預(yù)轉(zhuǎn)染HPMC后以TGF-β15ng/ml誘導(dǎo)24h)。采用Realtime PCR檢測(cè)miRNA589；應(yīng)用Realtime PCR、Western blot分別檢測(cè)E-cadherin、ZO-1、v

10、imentin、Ets-1 mRNA和蛋白的表達(dá)；應(yīng)用Realtime PCR檢測(cè)SIP1 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.Realtime PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1組miRNA589水平明顯下淵，TGF-β1+pre-miR-589組miRNA589表達(dá)則較TGF-β1組顯著上調(diào)(p<0.01)，而與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(p>0.05)。2.Realtime PCR與Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照

11、組相比，TGF-β1組vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，而E-cadherin、ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，以上改變?cè)趐re-miR-589+TGF-β1組均被抑制，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.Realtime PCR結(jié)果顯示，TGF-β1組Ets-1 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.01)，pre-miR-589+TGF-β1組Ets-1 mRNA表達(dá)水平較TGF-β1組有所下降，

12、但無(wú)顯著性差異(p>0.05)；Western blot結(jié)果顯示TGF-β1組Ets-1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上調(diào)(p<0.01)，pre-miR-589+TGF-β1組Ets-1蛋白表達(dá)水平較TGF-β1組明顯下調(diào)(p<0.05)，而與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)。Realtime PCR結(jié)果還證實(shí)，與對(duì)照組比較，TGF-β1組Ets-1下游的SIP1 mRNA表達(dá)上調(diào)，該作用可被pre-miR-589抑制。