鋅和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制.pdf

1、前言:
　　 腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)的主要替代方式之一。與血液透析相比，其具有費(fèi)用相對(duì)較低、有較佳的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性、能延緩殘余腎功能下降速度、較好的清除中分子物質(zhì)、對(duì)生活方式的影響較小等優(yōu)點(diǎn)而被更多的ESRD患者所接受。然而，在長(zhǎng)期腹膜透析過(guò)程中，腹膜長(zhǎng)期與非生理性的含糖腹透液持續(xù)接觸，以及反復(fù)發(fā)生的腹膜炎等諸多因素最終

2、可導(dǎo)致腹膜纖維化(Peritoeneal Fibrosis，PF)的發(fā)生，臨床上出現(xiàn)超濾失敗成為長(zhǎng)期腹膜透析患者退出的主要原因。因此探討PF的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、并尋找有效的防治措施具有重要的科學(xué)意義和臨床使用價(jià)值。
　　 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，以高糖(high glucose，HG)成分為主的腹膜透析液可以導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞(Rat peritoneal mesothelial cell，RPMCs)發(fā)生向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(epith

3、elial-to-mesenchymal transition, EMT)。EMT是腹膜發(fā)生纖維化的眾多環(huán)節(jié)中的起始環(huán)節(jié)和可逆階段。因此，臨床上對(duì)EMT的防治可能會(huì)延緩腹膜纖維化的進(jìn)程。其主要特征是失去上皮細(xì)胞的特性并獲得成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix components，ECM)的特性。關(guān)鍵步驟包括上皮細(xì)胞粘附連接的丟失;細(xì)胞骨架的重組;以及基底膜的瓦解和細(xì)胞遷移、侵襲的增強(qiáng)。發(fā)生轉(zhuǎn)分化的腹膜間皮

4、細(xì)胞具有肌成纖維母細(xì)胞的特性，其遷移能力和侵襲性顯著增強(qiáng)，并且分泌多種細(xì)胞因子，從而在腹膜纖維化及血管增生中發(fā)揮作用。因此，腹膜間皮細(xì)胞的EMT是腹膜透析患者腹膜功能逐漸降低、纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。
　　 鋅是機(jī)體內(nèi)除鐵以外含量最高的過(guò)渡元素，在細(xì)胞生物中起著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、催化和調(diào)節(jié)的作用，是人體內(nèi)300多種酶和轉(zhuǎn)錄因子的重要組成成分，直接參與了核酸、蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的分化和增殖以及許多重要細(xì)胞代謝過(guò)程。鋅缺乏會(huì)引發(fā)機(jī)體發(fā)育遲緩、

5、厭食、皮膚損壞、骨骼畸形、免疫力低下等癥狀。因此，鋅離子代謝的穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)維持機(jī)體正常生理功能至關(guān)重要。文獻(xiàn)證實(shí)，終末期腎臟病患者，其中包括血液透析和腹膜透析的患者均存在不同程度的鋅缺乏。以往研究證實(shí)，鋅補(bǔ)充能夠抑制或減輕一些動(dòng)物模型的纖維化和臨床上的慢性炎癥疾病，例如:肝纖維化、心肌纖維化、血管纖維化以及系統(tǒng)性纖維化等。鋅還可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激反應(yīng)是EMT的發(fā)生和發(fā)展的主要機(jī)制之一。相反，鋅缺乏能夠破壞上皮細(xì)胞膜完整性和功能

6、，影響膠原蛋白的合成等加重或?qū)е吕w維化。
　　 鋅離子不能自由通過(guò)細(xì)胞膜，特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜通道參與鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。在維持鋅穩(wěn)態(tài)的蛋白家族中，鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體(ZnTs)特別重要。ZnT1-7是金屬離子運(yùn)載體陽(yáng)離子擴(kuò)散促進(jìn)者(CDF)家族的成員，其作用是將鋅轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞或傳遞到細(xì)胞器內(nèi)。越來(lái)越多的證據(jù)表明ZnTs不僅直接參與了細(xì)胞的鋅離子穩(wěn)態(tài)代謝，同時(shí)還通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制影響著腫瘤和慢性炎癥性疾病等疾病的發(fā)生和發(fā)展。近期的研究證實(shí)，特定鋅轉(zhuǎn)運(yùn)

7、體基因的表達(dá)在調(diào)節(jié)鋅離子介導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下大鼠肺上皮細(xì)胞、肝臟細(xì)胞膜功能障礙的細(xì)胞保護(hù)作用中起到非常重要的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在研究鋅離子及ZnTs介導(dǎo)的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)HG誘導(dǎo)的RPMCs的EMT的影響，并進(jìn)一步探求其影響的相關(guān)機(jī)制。本研究將為明確鋅離子在腹膜透析液中的應(yīng)用以及腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化中的作用和相關(guān)機(jī)制，尋找有效干預(yù)腹膜纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與分子靶點(diǎn)提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 采用HG誘

8、導(dǎo)RPMCs制備的EMT體外模型，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hZnT-7，ZnT7 siRNA基因的RPMCs為研究對(duì)象，應(yīng)用原子吸收光譜方法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)鋅含量的變化，應(yīng)用免疫熒光和Western Blot技術(shù)檢測(cè)EMT指標(biāo)的表達(dá)變化，應(yīng)用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)基礎(chǔ)和HG刺激后的RPMCs內(nèi)ZnTs的表達(dá)變化，應(yīng)用RNAi技術(shù)阻抑ZnT7基因和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hZnT-7過(guò)表達(dá)ZnT7基因在RPMCS的表達(dá)，并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)RNAi對(duì)ZnT

9、7的基因沉默效果和hZnT-7過(guò)表達(dá)的效果，采用Western Blot技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、ELISA技術(shù)、MTT等技術(shù)檢測(cè)鋅離子及ZnT7對(duì)HG誘導(dǎo)的RPMCS的EMT的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、HG對(duì)細(xì)胞活力的影響
　　 MTT結(jié)果顯示，HG處理RPMCs后，細(xì)胞活力逐漸降低，具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性的特點(diǎn)。
　　 2、鋅離子對(duì)HG作用下細(xì)胞活力的影響
　　 MTT結(jié)果顯

10、示，HG處理RPMCs后，細(xì)胞活力逐漸降低，具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性的特點(diǎn)，而加入10μmZnSO4細(xì)胞活力升高。
　　 3、鋅離子對(duì)HG誘導(dǎo)的EMT的表達(dá)的影響
　　 HG刺激RPMCs導(dǎo)致α-SMA、CollagenⅠ表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)減少，RPMCs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，而鋅螯合劑導(dǎo)致α-SMA、CollagenⅠ表達(dá)進(jìn)一步增加，E-cadherin表達(dá)明顯減少。加入ZnSO4后，發(fā)現(xiàn)α-SMA、

11、CollagenⅠ表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)增多。
　　 4、鋅離子對(duì)HG誘導(dǎo)的TGF-β1分泌及ROS的表達(dá)的影響
　　 HG刺激RPMCs導(dǎo)致TGF-β1分泌及ROS的表達(dá)增加，而鋅螯合導(dǎo)致其表達(dá)進(jìn)一步增加。加入ZnSO4后，發(fā)現(xiàn)TGF-β1分泌及ROS的表達(dá)下降。
　　 5、鋅離子對(duì)HG誘導(dǎo)的MAPK、NF-κB、TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響
　　 HG刺激RPMCs導(dǎo)致MAPK、NF

12、-κB及TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活，加入ZnSO4后，發(fā)現(xiàn)MAPK、TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 6、ZnTs在正常和HG作用下的體外培養(yǎng)的RPMCs的表達(dá)變化
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示，正常RPMCs存在ZnT1-7的表達(dá)，HG刺激后ZnT7基因和蛋白的表達(dá)明顯升高。
　　 7、RNAi對(duì)ZnT7基因的沉默效果
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，RNAi可在mR

13、NA水平明顯抑制RPMCs的ZnT7表達(dá)，干擾后24 h即可出現(xiàn)ZnT7的表達(dá)下降，干擾后48 h為抑制效果最佳時(shí)間點(diǎn)，ZnT7表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的24％。
　　 8、hZnT-7-pcDNA3.1/myc-hisA對(duì)ZnT7基因過(guò)表達(dá)效果
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，hZnT-7-pcDNA3.1/myc-hisA可在mRNA水平明顯升高RPMCs的ZnT7表達(dá)，轉(zhuǎn)染后24h即可出現(xiàn)ZnT7的表達(dá)升高，轉(zhuǎn)染后48 h為過(guò)

14、表達(dá)效果最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　 9、ZnT7過(guò)表達(dá)和基因沉默對(duì)細(xì)胞活力的影響
　　 MTT結(jié)果顯示，單純ZnT7-RNAi和ZnT7過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力沒有明顯影響，在126mM HG處理的情況下，ZnT7過(guò)表達(dá)可提高RPMCS活力17.5％，而ZnT7-RNAi可降低大鼠腹膜間皮細(xì)胞活力10.5％。
　　 10、ZnT7過(guò)表達(dá)和基因沉默對(duì)細(xì)胞鋅轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　 Zinquin熒光染色結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下觀察，

15、可見鋅離子在ZnT7-RNAi組細(xì)胞核周圍的聚集明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，而在hZnT-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞核周圍的聚集明顯高于對(duì)照組細(xì)胞
　　 11、ZnT7過(guò)表達(dá)和基因沉默對(duì)EMT標(biāo)記蛋白(α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin)表達(dá)的Westren-blot分析
　　 單純ZnT7基因沉默和過(guò)表達(dá)后α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表達(dá)無(wú)明顯變化，而在HG刺激后，ZnT7-RNAi導(dǎo)致α-SMA

16、、CollagenⅠ表達(dá)升高，F(xiàn)-cadherin表達(dá)降低，而轉(zhuǎn)染hZnT-7則α-SMA、CollagenⅠ表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)增多。
　　 12、ZnT7過(guò)表達(dá)和基因沉默對(duì)TGF-β1分泌及TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的分析
　　 Elisa結(jié)果顯示，ZnT7-RNAi干擾48 h后，予以HG作用48h，RPMCs培養(yǎng)液內(nèi)的TGF-β1蛋白含量，TGF-β/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白p-sm

17、ad3和p-smad4蛋白表達(dá)較對(duì)照組和HG組明顯升高，而hZnT-7轉(zhuǎn)染/HG組的TGF-β1蛋白含量，p-smad3和p-smad4蛋白表達(dá)較對(duì)照組和HG組明顯降低。
　　 13、統(tǒng)計(jì)分析
　　 數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間比較采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的兩兩比較采用Tukey's檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)論:
　　 1、鋅補(bǔ)充可阻

18、抑HG誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，而鋅缺乏可促進(jìn)HG誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
　　 2、鋅離子抑制HG誘導(dǎo)的大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制是:
　　 ①鋅可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及關(guān)鍵纖維化因子的過(guò)表達(dá)而抑制大鼠腹膜間皮細(xì)胞的的轉(zhuǎn)分化。
　　 ②鋅可通過(guò)抑制MAPK、 TGF-β/Smad和NF-κB信號(hào)通路的活化而抑制大鼠腹膜間皮細(xì)胞的的轉(zhuǎn)分化。
　　 3、大鼠腹膜間皮細(xì)胞存在ZnT1-7的表達(dá)，Z