MMP-3、MMP-9在退變椎間盤髓核組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　腰椎間盤退行性病變是腰椎自然老化、退化的病理過程，是脊柱外科比較常見的疾病之一。腰部疾病腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation,LDH)是臨床上最為常見的疾病。LDH因年齡、性別、患病時(shí)間以及部位的差異，其臨床表現(xiàn)與臨床癥狀也不盡相同，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸為腰痛、痹癥等中醫(yī)學(xué)范疇。近幾年來該病呈上升趨勢發(fā)展，且發(fā)病趨勢有逐漸由中老年人群向青壯年人群擴(kuò)展的趨勢，腰椎間盤退變是腰椎退行性疾病的病理基

2、礎(chǔ)，腰椎退行性疾病表現(xiàn)為椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的降解、椎間盤細(xì)胞減少；腰椎間盤的力學(xué)性能發(fā)生改變的原因是細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而誘發(fā)腰椎間盤的突出、脫出，進(jìn)一步引起相應(yīng)的體征和臨床癥狀。迄今為止，醫(yī)學(xué)界對(duì)于椎間盤退行性變的原因的認(rèn)識(shí)尚不完全清楚，能確定的是其因素包括多種，如遺傳性、細(xì)胞因子表達(dá)異常、患者年齡特征變化、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetall oproteinases， MMPs）活

3、性異常增高、生物力學(xué)改變等因素，都參與了椎間盤的退變過程。被認(rèn)為在椎間盤退變過程中起著關(guān)鍵性作用的是 MMPs活性的異常增高。它能夠減少細(xì)胞外基膜組分的作用。自發(fā)現(xiàn)第一種MMPs以來，到目前共在MMPs家族中分離出來28個(gè)成員，發(fā)現(xiàn)的MMPs家族成員按被發(fā)現(xiàn)的順序進(jìn)行命名，分別命名為 MMP-1~MMP-28。正常的人體椎間盤組織中，含有少量的 MMPs和MMPs抑制劑（TIMPs），MMPs與 TIMPs之間的表達(dá)存在一定比例關(guān)系，他

4、們共同維持 ECM的合成與降解的平衡狀態(tài)。在退變椎間盤組織中，MMP-3和MMP-9受細(xì)胞因子以及自身調(diào)節(jié)等多因素的調(diào)節(jié)，活性表達(dá)顯著增高，因而這兩個(gè) MMPs家族成員被認(rèn)為是腰椎間盤組織退變中的重要酶類，與椎間盤組織的退變有密切的關(guān)系。在椎間盤退變的檢查診斷中，核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)是最主要的影像學(xué)檢查方法，目前該檢查診斷方法在臨床上的應(yīng)用非常廣泛。在椎間盤退變的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中，Pfirr

5、mann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)是脊柱外科醫(yī)師共同認(rèn)可的椎間盤退變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。目前，學(xué)術(shù)界還尚未出現(xiàn)關(guān)于 MMPs在不同椎間盤退變的Pfirrmann分級(jí)表達(dá)中的相關(guān)研究。
　　研究目的：
　　基于以上背景，本文研究的目的在于：1）通過檢測MMP-3和MMP-9在正?；虍惓Ｗ甸g盤髓核組織中的表達(dá)情況，觀察其表達(dá)是否存在差異；2）通過檢測MMP-3和MMP-9在正?；虍惓Ｗ甸g盤髓核組織中的表達(dá)情況，分析探討二者之間的存在的相關(guān)性；3）按照被認(rèn)可

6、的 Pfirrmann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)椎間盤退變進(jìn)行分級(jí)，觀察 Pfirrmann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)下不同分級(jí)的椎間盤退變的 MMP-3、MMP-9表達(dá)是否存在差異，如果存在差異，分析具體差異情況及原因。
　　方法：
　　選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨五科2013年06月~2013年12月期間收治的腰椎間盤突出癥患者46例，取其髓核標(biāo)本為退變組。46例髓核標(biāo)本中，來自男性患者的21例，來自女性患者的25例，患者年齡在30~62歲之間，平均年齡為

7、(42.6±2.2)歲，其中2例為L2/L3，3例為L3/L4，18例為L4/L5，23例為L5/S1。退變組所有患者依據(jù)MRI檢查結(jié)果，以腰椎間盤突出的類型進(jìn)一步分組，其中23例突出型的歸為突出組，16例脫出型的歸為脫出組，7例游離型的歸為游離組。另選擇同期因腰椎骨折在我院本科室接受治療的12例患者的正常腰椎間盤髓核組織標(biāo)本為對(duì)照組。12例腰椎間盤髓核組織標(biāo)本來源于男性的7例，來源于女性的5例，年齡在年齡17~36歲之間，平均年齡為(

8、26.8±1.8)歲，其中6例為L1/L2，4例為L2/L3，2例為L3/L4。退變組與對(duì)照組兩組患者的髓核組織均由同一組手術(shù)醫(yī)師在術(shù)中取出，取出后用生理鹽水清洗干凈置于甲醛溶液（濃度為10％）中浸泡，浸泡時(shí)間為24h，浸泡后送病理科脫水、浸蠟、固定、切片等常規(guī)處理，將髓核組織標(biāo)本制成切片（每個(gè)髓核組織標(biāo)本做成6張切片，每個(gè)切片厚度為5μm），切片置于0~4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。取備制好的切片行HE染色，觀察兩組標(biāo)本的形態(tài)學(xué)差異，并根據(jù)Pf

9、irrmann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，并利用鼠抗人MMP-3和MMP-9單克隆抗體，采用免疫組化方法檢測兩組標(biāo)本的椎間盤組織中表達(dá)情況并比較分析。陽性表達(dá)指征為細(xì)胞漿內(nèi)檢測出棕黃色或黃色顆粒。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)照組（正常腰椎間盤髓核組織）：切片可見細(xì)胞外基質(zhì)中有軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞散在分布，細(xì)胞輪廓清晰，包膜結(jié)構(gòu)完整性好，細(xì)胞形態(tài)多為多角形或短梭形兩種，胞漿呈均勻分布，細(xì)胞核多表現(xiàn)為藍(lán)紫色，且數(shù)量較多，軟骨陷窩中分布的數(shù)量較多

10、，周圍膠原呈紅色，整體上看排列整齊規(guī)則，呈現(xiàn)出網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。退變組（腰椎間盤突出癥患者的腰椎間盤髓核組織）：切片顯示軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞呈均勻狀分布，較少數(shù)量的細(xì)胞分布于軟骨陷窩中，形態(tài)多為梭形，且輪廓不十分清晰，線粒體在細(xì)胞內(nèi)數(shù)量較少，而溶酶體聚集明顯，周圍膠原組織排列不整齊，為紅色，整體上呈現(xiàn)出空泡樣構(gòu)造。
　　2.免疫組化檢測HE染色結(jié)果：對(duì)照組和退變組腰椎間盤髓核組織中MMP-3和MMP-9都分布于細(xì)胞漿內(nèi)，免疫組化檢測顯示為陽

11、性的腰椎間盤髓核組織中的MMP-3和MMP-9在顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，而軟骨細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕褐色或棕黃色顆粒。
　　2.1、對(duì)照組髓核組織細(xì)胞中MMP-3的陽性表達(dá)率為(6.76±2.32)%，突出組為(27.85±7.52)%，脫出組為(61.64±9.74)%，游離組為(76.52±6.72)%，可見退變組髓核組織細(xì)胞中MMP-3的陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，且差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且退變組各子組中（不

12、同的分型中）髓核組織細(xì)胞中MMP-3的陽性表達(dá)率也具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　2.2、對(duì)照組髓核組織細(xì)胞中MMP-9的陽性表達(dá)率為(7.74±2.36)%，突出組為(45.06±4.43)%，脫出組為(81.43±3.41)%，游離組為(84.35±4.34)%?？梢娡俗兘M髓核組織細(xì)胞中MMP-9的陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，且差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而脫出組與游離組髓核組織細(xì)胞中MMP-9的陽性表達(dá)

13、率相比，差異無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.3、在Pfirrmann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)下分為II級(jí)的髓核組織細(xì)胞中，MMP-3的陽性表達(dá)率為(8.78±2.62)%，III的為(33.47±6.79)%，IV的為(51.24±10.59)%，V級(jí)為(66.73±9.84)%，可見在Pfirrmann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)下，不同級(jí)別之間的MMP-3的陽性表達(dá)率比較差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.4、在Pfirrman

14、n分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)下分為II級(jí)的髓核組織細(xì)胞中，MMP-9的陽性表達(dá)率為(10.53±3.43)%，III級(jí)的為(52.47±10.42)%，IV級(jí)的為(67.46±9.64)%，V級(jí)的為(83.36±6.68)%，可見在 Pfirrmann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)下，不同級(jí)別之間的 MMP-9的陽性表達(dá)率比較差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.5、經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，退變組髓核組織細(xì)胞中MMP-3的陽性表達(dá)與髓核組織細(xì)胞中

15、MMP-9的陽性表達(dá)呈正相關(guān)（0＜r＜1）。
　　結(jié)論：
　　1.在退變的椎間盤髓核組織中MMP-3、MMP-9的陽性表達(dá)顯著高于正常的椎間盤組織中MMP-3、MMP-9的陽性表達(dá)，MMP-3和MMP-9在腰椎間盤組織中表達(dá)的變化可能參與了腰椎間盤組織的退變的過程。
　　2.MMP-3和MMP-9在退變的腰椎間盤髓核組織中成明確的正相關(guān)性，推測MMP-9可能參與了MMP-3活化過程。
　　3.在Pfirrmann