HIF-1α、MMP-2在退變腰椎間盤髓核中的表達(dá)及相關(guān)意義.pdf

1、研究背景：
　　 腰椎間盤突出癥是脊柱外科最常見的病癥之一,導(dǎo)致腰椎間盤突出癥的病理基礎(chǔ)主要是腰椎間盤退變(intervertebral disc degeneration；IVDD),其表現(xiàn)為凝膠樣髓核消失,髓核與纖維環(huán)原有清晰界限逐漸消失,纖維環(huán)板層粗糙和進(jìn)行性纖維化。據(jù)統(tǒng)計(jì):全世界約80％～90％的人曾經(jīng)受到過腰腿痛的折磨,其中腰椎間盤退變、突出是最常見的病因,其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,臨床治療難于達(dá)到理想境界。綜合既

2、往研究表明,IVDD是多因素協(xié)同作用導(dǎo)致的,包括遺傳因素、生物力學(xué)、生物化學(xué)因素等。以基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)等為代表的基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloprotelnase；MMPS)引起基質(zhì)成分合成、降解紊亂而造成細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化是椎間盤力學(xué)特征喪失的直接原因之一,進(jìn)而引起一系列的臨床癥狀。近年來的研究表明缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α；HIF-1α)在人類突出腰椎間

3、盤中有表達(dá),從而得出結(jié)論:HIF-1α在人椎間盤細(xì)胞的生成和突出間盤重吸收方面可能起重要作用。在人類的退變椎間盤中HIF-11α與MMP-2的表達(dá)有無相關(guān)性及它們是如何參與椎間盤的退變過程等方面尚未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。有鑒于此,本實(shí)驗(yàn)通過對人類正常椎間盤和退變椎間盤組織的對比,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法,觀察和分析人類退變椎間盤中的HIF-1α和MMP-2的表達(dá)情況。
　　 研究目的：
　　 探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1

4、α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在人類退變腰椎間盤髓核組織中的表達(dá)變化情況；評價(jià)HIF-1α、MMP-2在人類腰椎間盤退變過程中的作用,并分析兩者之間的關(guān)聯(lián)性。
　　 研究方法
　　 取材均來自南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院脊柱外科2008年1月～2009年6月收集的57例手術(shù)標(biāo)本,分為實(shí)驗(yàn)組和對照組:實(shí)驗(yàn)組45例,對照組12例。實(shí)驗(yàn)組為45例確診腰椎間盤突出癥需手術(shù)切除的患者,術(shù)中切除的仍位于纖維環(huán)內(nèi)的椎間盤髓核組織,

5、其中男33例,女12例；年齡為20～40歲,平均年齡為31.5歲,病程為3個(gè)月～10年。突出部位:L4/L5椎間盤突出23例,L5/S1椎間盤突出20例,L4/L5、L5/S1椎間盤突出2例。根據(jù)術(shù)前MRI影像表現(xiàn),對實(shí)驗(yàn)組退變腰椎間盤髓核組織分為A、B、C三組,A組:椎間盤信號強(qiáng)度輕度減低,B組:椎間盤信號強(qiáng)度中度減低；C組:椎問盤信號明顯減低；對照組12例為正常椎間盤髓核組織,來源于青年脊柱骨折患者行前路減壓內(nèi)固定術(shù)時(shí)切除的椎問盤髓

6、核組織,術(shù)前MRI的T2像見椎間盤呈均勻高信號,其中男10例,女2例；年齡為21～45歲,平均33.7歲。標(biāo)本取出后均用4％的多聚甲醛固定,而后立即將收集的每個(gè)椎間盤髓核組織行石蠟包埋切片,制備5μm的厚組織切片,保存于0～4℃冰箱,HE染色和待免疫組織化學(xué)檢查。
　　 HIF-1α及MMP-2均購自武漢博士德生物有限公司。具體步驟如下:①石蠟切片常規(guī)脫蠟。②3％雙氧水室溫孵育5～10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。③雙

7、氧水沖洗3次,熱抗原修復(fù)后,PBS(PH7.2～7.6)沖洗3min×2次,滴加5％BSA封閉液,室溫20min。甩去多余液體,不洗。④滴加適當(dāng)稀釋一抗(抗人HIF-1α單克隆抗體1:100,或抗人MMP-2單克隆抗體1:100),4℃冰箱過夜。PBS洗2min×3次。⑤滴加生物素化二抗工作液,20～37℃,20分鐘。PBS洗2min×3次。⑥滴加試劑SABC,20～37℃,20min。PBS洗5min×3次。⑦顯色劑顯色(DAB試劑盒

8、)。自來水充分沖洗,復(fù)染,封片。顯微鏡觀察。
　　 HIF-1α及MMP-2免疫組化染色都定位于細(xì)胞漿,故它們的陽性結(jié)果均表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片由兩名病理醫(yī)生在10×20光鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野“盲法”閱片,確定細(xì)胞總數(shù)及陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)選取10個(gè)視野內(nèi)陽性軟骨細(xì)胞總數(shù)÷軟骨細(xì)胞總數(shù)×100％以計(jì)算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對計(jì)數(shù)資料進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。
　　

9、 結(jié)果
　　 免疫組化結(jié)果為HIF-1α及MMP-2均定位于細(xì)胞漿,故顯微鏡下見HIF-1α及MMP-2的免疫組化陽性結(jié)果均表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕黃色或棕褐色顆粒,細(xì)胞核為淡藍(lán)色。HIF-1α在對照組、輕度退變組、中度退變組、重度退變組椎間盤髓核組織中的表達(dá)分別為8.92±3.41％、46.81±3.63％、66.88±4.60％、89.63±2.27％；MMP-2在對照組、輕度退變組、中度退變組、重度退變組椎間盤髓核組織中的

10、表達(dá)分別為9.61±3.03％、47.31±4.41％、69.54±5.96％、90.05±3.16％。HIF-1α、MMP-2在實(shí)驗(yàn)組退變的椎間盤中的表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05),而且不同退變程度的表達(dá)也不同(P<0.05),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均有顯著差異。組間相關(guān)系數(shù)(r)為0.959,表明HIF-1α和MMP-2在退變的椎間盤組織中的表達(dá)呈正相關(guān)的關(guān)系。
　　 結(jié)論
　　 HIF-1α、MMP-2均可能參與了人類腰椎