樟芝深層發(fā)酵活性物質(zhì)的研究.pdf

1、樟芝Antrodia camphorata是主要分布在中國(guó)臺(tái)灣山區(qū)海拔450～2000米之間的牛樟樹腐朽的心材內(nèi)壁的珍稀藥用真菌。 樟芝多糖和樟芝三萜是樟芝(Antrodia camphorata)的主要生物活性成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，樟芝具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、解毒、抗炎等功效，有很好的藥用價(jià)值，是一種極具開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的藥用菌，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。獲得樟芝生物活性成分的途徑有兩種，一種是從子實(shí)體中提

2、取，一種是從發(fā)酵產(chǎn)物中獲取。子實(shí)體質(zhì)量不穩(wěn)定易受栽培環(huán)境影響，而且栽培周期長(zhǎng)，一般需要2～3個(gè)月或者是更長(zhǎng)的時(shí)間，發(fā)酵獲取的目標(biāo)產(chǎn)物，可通過(guò)發(fā)酵條件的控制來(lái)保證質(zhì)量穩(wěn)定且生產(chǎn)周期短。 本研究以樟芝菌絲體生物量和胞內(nèi)三萜為目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行了發(fā)酵工藝的優(yōu)化，并研究了其發(fā)酵產(chǎn)物的代謝規(guī)律。確定發(fā)酵培養(yǎng)條件為：40 g/L葡萄糖， 6 g/L豆餅粉，1 g/L K<,2>HPO<,4>，0.5g/L MgSO<,4>，V<,81> 100

3、mg/L，自然pH，接種量為20％，裝液量為100mL/250mL三角瓶，轉(zhuǎn)速100r/min，26℃恒溫培養(yǎng)6d，胞內(nèi)三萜產(chǎn)量達(dá)15.25mg/100mL；菌絲生物量是0.53g/100mL。樟芝在培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期接種，即72h，而大約168h后進(jìn)入衰亡期，菌體自溶，衰亡，菌絲生物量緩慢下降，胞內(nèi)三萜產(chǎn)量也隨之下降。因此樟芝發(fā)酵時(shí)最好在72h左右接種，可以避免或縮短停滯期，縮短發(fā)酵周期，收集胞內(nèi)三萜時(shí)可在穩(wěn)定期，即72～168h左右

4、，此時(shí)菌絲生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物積累達(dá)最高。 將樟芝深層發(fā)酵菌絲體用不同溶劑提取胞內(nèi)三萜類物質(zhì)，結(jié)果表明用甲醇靜置過(guò)夜、乙醇靜置過(guò)夜、甲醇超聲波提取和95％的乙醇超聲波提取的提取物HPLC圖譜中峰的高度基本相同，峰數(shù)也相同，各峰的分離度也好，而用沸水和碳酸氫鈉提取，峰比較少，峰高比較矮，分離度不好，考慮到甲醇較乙醇毒性更強(qiáng)的特點(diǎn)，本研究采用不同濃度的乙醇不同時(shí)間超聲波提取樟芝三萜類物質(zhì)，采用HPLC圖譜與體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法

5、。研究表明，在50μg/mL時(shí)， A、D、E、F四種方法的提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞株L1210均有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率超過(guò)了50％，與α=0.68時(shí)，A、D、E、F有一共同的色譜峰相對(duì)應(yīng)，只是相對(duì)面積有所不同，相對(duì)面積大的對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率相對(duì)也表現(xiàn)得比較明顯；也是在50μg/mL時(shí)，D、E兩種方法提取的三萜組分對(duì)SW620的抑制率超過(guò)了50％，與α=0.63和α=0.68時(shí)，D、E也有共同的色譜峰相對(duì)應(yīng)，相對(duì)面積差不多。這為以后在α=0.6

6、3和α=0.68處進(jìn)一步分離純化獲得樟芝抗腫瘤活性成分奠定了良好的理論基礎(chǔ)。樟芝菌體培養(yǎng)結(jié)束后，去除菌絲體，將3份100mL的發(fā)酵濾過(guò)液分別用無(wú)水乙醚(E)、戊烷：無(wú)水乙醚(P/E)=1∶1、戊烷：二氯甲烷(P/D)=2∶1多次萃取，合并萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥，揮干有機(jī)溶劑，最終獲得約1mL具有濃郁芳香氣味的油狀物質(zhì)待用。 GC-MS分析結(jié)果表明，三種不同溶劑提取樟芝發(fā)酵液所得的化合物數(shù)量存在著明顯的差異，這可能與溶劑的極性有

7、關(guān)。在用P/E混合溶劑提取所得的化合物最多，可達(dá)45種，包括8種酯類，16種醇類，5種酸類，2種醛類，5種雜環(huán)類，4種碳?xì)浠衔锖?種酮類化合物。用溶劑E和混合溶劑P/D提取所得的化合物只有40種和20種。分別包括5種酯類，15種醇類，5種酸類，3種醛類，6種雜環(huán)類，2種碳?xì)浠衔锖?種酮類化合物以及9種酯類，4種醇類，2種酸類，1種醛類，1種雜環(huán)類，2種碳?xì)浠衔锖?種酮類化合物。 GC-0分析結(jié)果表明，有著甜味的乙酸乙酯，桃