長鏈非編碼RNA遺傳變異與乳腺癌易感性關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅全球女性健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年女性新發(fā)乳腺癌逾167萬例，占所有新發(fā)惡性腫瘤的25.1％;由乳腺癌導(dǎo)致的死亡逾52萬例，占所有惡性腫瘤引起死亡的14.7％。在我國，乳腺癌發(fā)病率以每年3-5％的速度遞增，并且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果。相同的環(huán)境危險(xiǎn)因素暴露下僅部分個(gè)體最終發(fā)生乳腺癌，提示遺傳背景差異可能導(dǎo)致不同個(gè)體乳腺癌易感性不同。因此

2、，鑒定遺傳標(biāo)志物以篩選具有遺傳易感性的乳腺癌高危人群，進(jìn)而采取針對性的預(yù)防措施，對降低乳腺癌發(fā)病率和死亡率具有重要意義。
　　新近研究已證實(shí)長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的異常表達(dá)參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，特定lncRNA可能作為腫瘤診斷的標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)。LncRNA主要是通過與目標(biāo)基因或特定蛋白的結(jié)合來發(fā)揮調(diào)控功能，基因組上lncRNA序列遺傳變異可能改變lncRNA自身的表達(dá)水平或

3、影響其與目標(biāo)序列/蛋白的結(jié)合，繼而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，本課題擬首先對乳腺癌癌和癌旁組織RNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）以系統(tǒng)篩選異常表達(dá)的lncRNA，進(jìn)而分析lncRNA上遺傳變異與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)。
　　本課題研究設(shè)計(jì)包含兩部分內(nèi)容:(1)測序篩選階段，采用illumina公司二代測序平臺Hiseq1500，針對5例乳腺癌新發(fā)患者的癌和癌旁組織RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。應(yīng)用FastQC

4、軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，利用Bowtie/Tophat軟件對序列進(jìn)行拼接，通過Tophat(v2.0.9)軟件將所得序列定位于人類基因組數(shù)據(jù)庫(hg19)上，注釋之后挑選出轉(zhuǎn)錄本長度大于200bp以上非編碼RNA，再通過Cuffiinks(v2.2.1)評價(jià)表達(dá)水平。應(yīng)用R軟件DESeq2包進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選顯著差異表達(dá)的lncRNA。(2)關(guān)聯(lián)研究階段，采用病例對照研究，納入1486例醫(yī)院來源的新發(fā)乳腺癌患者，1519健康對照

5、來自參加江蘇省城鄉(xiāng)慢性非傳染性疾病調(diào)查的人群，按年齡和居住地區(qū)（城鄉(xiāng)比例）等分布特征與病例頻數(shù)匹配。通過RegulomDB進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，篩選lncRNA區(qū)域及其上下游2kb范圍內(nèi)所有功能性遺傳變異，納入標(biāo)準(zhǔn):RegulomeDB評分1-3;中國漢族人群中最小等位基因頻率(MAF)≥0.05;排除在中國人群中高連鎖不平衡(LD)的遺傳變異（r2＞0.8，優(yōu)先納入評分高的位點(diǎn)，如果評分一致，隨機(jī)選?。＠肧equenom公司的Mas

6、sARRAY分子量陣列技術(shù)平臺對上述功能性遺傳變異進(jìn)行基因分型。應(yīng)用Logistic回歸模型在各遺傳模型下計(jì)算遺傳變異的關(guān)聯(lián)P值、比值比(odds ratio，OR)及其95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)。
　　測序篩選階段共發(fā)現(xiàn)11個(gè)差異表達(dá)lncRNA位于常染色體區(qū)域、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)校正P值≤0.05且對數(shù)轉(zhuǎn)換的表達(dá)差值(log2foldchange)

7、≥2。關(guān)聯(lián)研究階段納入27個(gè)潛在功能性遺傳變異，去除4個(gè)引物設(shè)計(jì)失敗和3個(gè)基因分型率低于95％，最終獲得20個(gè)位點(diǎn)的分型結(jié)果。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，位于lncRNA AC104135.3上遺傳變異rs11471161的TT等位基因與降低的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(相加模型:OR=0.86，95％CI=0.78-0.96，P=7×10-3);而位于lncRNA RP11-1060J15.4上遺傳變異rs3751232的A等位基因與升高的

8、乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(相加模型:OR=1.26，95％CI=1.10-1.45，P=1×10-3);在校正了年齡、初潮年齡和絕經(jīng)狀態(tài)之后，rs11471161和rs3751232仍然與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(rs11471161，OR=0.84，95％ CI=0.74-0.94，P=4×10-3; rs3751232，OR=1.20，95％ CI=1.02-1.40，P=2.7×10-2)。分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs11471161在較低初潮年齡、較

9、低首胎活產(chǎn)年齡、絕經(jīng)前和TNM中晚期乳腺癌患者中與降低的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（P值分別為0.012，0.023，0.042和0.026），且rs11471161只在雌激素受體(ER)陽性、孕激素受體(PR)陽性和人類表皮生長因子受體2（HER2）陰性的腫瘤亞組中表現(xiàn)為保護(hù)的效應(yīng)（P值分別為0.006，0.018和0.008）;rs3751232則與ER+和PR+腫瘤亞組顯著增加的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（P值分別為0.004和0.036）。但是遺傳

10、變異與乳腺癌的關(guān)聯(lián)在不同的亞組間皆不存在異質(zhì)性（異質(zhì)性檢驗(yàn)P＞0.05）。此外，共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)AC104135.3與乳腺癌相關(guān)的基因ERBB2有顯著的共表達(dá)相關(guān)(r=0.99，F(xiàn)DR校正P=0.0149)。
　　本課題通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)建立乳腺癌lncRNA表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)lncRNAAC104135.3和RP11-1060J15.4相關(guān)遺傳變異rs11471161和rs3751232與乳腺癌易感性顯著關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果為乳腺癌