低頻遺傳變異與中國男性非梗阻性無精子癥遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、不孕不育在本世紀(jì)已成為人類生殖健康領(lǐng)域最為常見的疾病之一，其預(yù)防、診斷和治療不僅標(biāo)志著生殖健康水平的高低，也直接關(guān)系著人類的生存繁衍。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，不孕不育已經(jīng)影響了世界范圍內(nèi)10-15％的夫婦，其中由于男性問題導(dǎo)致的不育將近50％。而無精子癥，即射出的精液中沒有精子，是引起男性不育的重要原因。臨床上精液經(jīng)3次離心鏡檢仍未見精子，且排除不射精和逆行射精等情況后方可確診。按照有無輸精管道梗阻，可將無精子癥分為梗阻性和非梗阻

2、性兩種。其中非梗阻性無精子癥(non-obstructiveazoospermia，NOA)占了很大一部分。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，成年男性NOA患病率將近1％，對于男性生殖有嚴(yán)重影響。因此，如何識別高危人群，針對性地開展篩查，早期診斷NOA是當(dāng)前面臨的重要挑戰(zhàn)。既往研究表明，NOA的形成是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結(jié)果，其中遺傳因素約占男性不育因素的15％-30％。而在相同暴露因素下，遺傳背景的差異可能影響個體對NOA的易感性。目前已報道

3、的遺傳因素包括:染色體數(shù)目異常，Y染色體微缺失，多種生物學(xué)通路中基因的突變以及常染色體多態(tài)等。在眾多遺傳因素中，單個常染色體多態(tài)位點的效應(yīng)比較弱，但是在人群中穩(wěn)定且普遍存在。近年來，全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide Association Studies，GWAS)作為一種探索復(fù)雜疾病病因的強有力工具，已經(jīng)被應(yīng)用到了NOA病因的研究之中。該技術(shù)能快速篩查全基因組范圍內(nèi)的常見遺傳標(biāo)志以發(fā)現(xiàn)與特定表型相關(guān)的遺傳變異，所采用的研究樣本

4、量較大，并通常輔以多個獨立的研究進行后期的驗證和篩選。前期，本課題組通過多階段病例對照研究先后發(fā)現(xiàn)了染色體1p13.3，1p36.32，1q42.13，6p21.32，6p22，10q25.3及12p12.1等七個區(qū)域的多個NOA易感基因，從遺傳角度出發(fā)，解釋了部分NOA的發(fā)病原因，提示遺傳變異在NOA的發(fā)病中起著重要的作用。但是，GWAS所發(fā)現(xiàn)的常見遺傳變異(最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)≥

5、5％)的效應(yīng)相對較弱(Odds ratio，OR:1.1-1.5)，且88.9％位于基因非編碼區(qū)或荒漠區(qū)，僅能解釋NOA的小部分遺傳機制。而低頻遺傳變異(MAF＜5％)的遺傳貢獻尚不明確，科學(xué)家們推測這類遺傳變異可能具有更大的效應(yīng)，對其重要性的忽視或為遺傳度遺失的重要原因之一。因此，有必要開展一項基于二代測序篩選技術(shù)的外顯子關(guān)聯(lián)研究(exome-wide associationstudy, EXWAS)，以系統(tǒng)研究低頻遺傳變異與中國男性

6、NOA遺傳易感性之間的關(guān)聯(lián)。
　　本研究采用多階段病例對照研究設(shè)計對單個遺傳變異進行研究:初篩階段所納入的病例為2005年4月至2012年1月在江蘇省生殖醫(yī)學(xué)中心收治的NOA患者，共962例;對照為從2004年至2006年間在江蘇省參與社區(qū)慢性非傳染性疾病篩查的健康人群中隨機選取的男性個體（已婚育），共1，348例。一期驗證納入了來源于江蘇及上海地區(qū)的714例NOA病例及1，398例有健康生育史男性對照。二期驗證則納入了來源于武漢

7、及沈陽地區(qū)的1，454例NOA病例及3，850例有健康生育史男性對照。初篩階段采用美國Illumina公司的Infinium(R) HumanExome Beadchip芯片對962例NOA病例及1，348例健康對照進行基因分型，該芯片包含了從超過12，000個個體的全基因組測序和外顯子組測序數(shù)據(jù)中挑選出的247，870個遺傳變異。在對研究變量和研究對象進行質(zhì)量控制后，共939例病例和1，335例對照、40，936個低頻遺傳變異進入后續(xù)

8、分析，后期采用logistic回歸模型在相加模型下計算遺傳變異關(guān)聯(lián)P值、比值比(odds ratio，OR)值以及95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)。滿足以下要求的位點納入一期驗證:1）病例與對照關(guān)聯(lián)P值≤1.0×10-4;2）滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的位點之間存在高連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)(r2＞0.8)時，僅納入P值最低的位點;3）位點基因分型圖質(zhì)量較好，分簇清楚。一期驗證的位

9、點關(guān)聯(lián)分析結(jié)果滿足P≤0.05時將進入二期驗證。初篩階段，本研究除對單個遺傳位點進行分析外，還運用兩種方法進行了以基因為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)分析:Burden test的MAF界值為1％，共納入6，919個基因;SKAT-O(sequence kernel association optimal test)的MAF界值為5％，共納入7，979個基因進入后續(xù)分析。最終本研究發(fā)現(xiàn)了3個與NOA發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)的低頻遺傳變異。其中位于染色體6p22.2

10、區(qū)域HISTIH1E基因上的低頻遺傳變異rs2298090及位于染色體6p21.33區(qū)域FKBPL基因上的低頻遺傳變異rs200847762均顯著降低了中國漢族男性患NOA的風(fēng)險性(rs2298090 A＞G:OR=0.29，95％CI=0.21-0.40，P=6.93×10-14;rs200847762 G＞A: OR=0.10，95％CI=0.05-0.22，P=1.16×10-8);而位于染色體6p21.33區(qū)域MSH5基因上低頻

11、遺傳變異rs11754464 G＞A與NOA發(fā)病風(fēng)險的增加顯著相關(guān)(OR=1.78，95％CI=1.43-2.22，P=1.03×10-6)。條件分析(Conditionalanalysis)提示，該三個遺傳變異為染色體6p21.33、6p22.2區(qū)域NOA易感性的獨立效應(yīng)位點。此外，以基因為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)CFTR基因與NOA發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)(P=5.77×10-7)。但是，該基因上的與NOA相關(guān)性最顯著的遺傳變異rs1137577