OST對(duì)KCNE1蛋白糖基化影響的初步研究.pdf

1、KCNE1作為輔助亞基與功能亞基KCNQ1以4:2的比例裝配形成異源多聚體KCNQ1/KCNE1鉀通道。KCNE1單獨(dú)表達(dá)不能形成功能性通道，KCNQ1/KCNE1共同表達(dá)使KCNQ1通道電流增加，激活速率減慢，電壓依賴性曲線呈正向偏移，因而KCNE1對(duì)于KCNQ1/KCNE1通道慢激活特征的維持是不可替代的。
　　KCNE1在N-端胞外段有2個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)，分別是第5和第26位的天冬酰胺。已發(fā)現(xiàn)的N5位N-連接糖基化的突變

2、(T7I)與LQTS及尼爾森綜合征有關(guān)。這提示我們，KCNE1作為輔助亞基，其N-連接糖基化位點(diǎn)的突變可能對(duì)KCNQ1通道具有調(diào)節(jié)作用，但具體的調(diào)節(jié)效應(yīng)不明，KCNE1糖基化的調(diào)控機(jī)制也沒有明確的報(bào)道。
　　N-連接糖基化通常始于新生肽鏈翻譯過程中通過易位子(translocon)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的過程中。高甘露寡聚糖在糖基轉(zhuǎn)移酶(oligosaccharyltransferase OST)的作用下從多萜醇Dol-PP轉(zhuǎn)移到靶蛋白的天

3、冬酰胺上。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的OST是由9個(gè)亞基組成的復(fù)合體，其中STT3A和STT3B是完成酶促反應(yīng)的關(guān)鍵分子，它們具有識(shí)別寡糖底物和糖基化位點(diǎn)的雙重功能。
　　我們通過siRNA konck-down技術(shù)下調(diào)小鼠心肌細(xì)胞中stt3b的表達(dá)，經(jīng)檢測(cè)stt3b在mRNA和蛋白水平分別下降了96.1％(P<0.01)和17％(P<0.01)。STT3B蛋白的下調(diào)影響了KCNE1 N-連接糖基化的水平，使其蛋白糖基化與非糖基化比例下降了20

4、％(P<0.01)。由此證明了KCNE1蛋白N-連接糖基化受到OST酶的調(diào)節(jié)。
　　為了解KCNE1 N-連接糖基化的功能，我們構(gòu)建了針對(duì)KCNE1 N-連接糖基化位點(diǎn)的突變體：KCNE1-N5Q、KCNE1-N26Q、KCNE1-N5，26Q，并在HEK293細(xì)胞系中與KCNQ1共同表達(dá)。運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，我們以電流密度、標(biāo)準(zhǔn)化I-V曲線及通道激活/失活時(shí)間常數(shù)t值等電生理參數(shù)為指標(biāo)，這三種突變體與野生型KCNQ1/KCNE