AMPK調(diào)控組蛋白糖基化修飾的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.探究治療二型糖尿病的常用藥物二甲雙胍（metformin）對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制，初步弄清其用于治療腫瘤的理論基礎(chǔ)；
　　2.探索AMPK在metformin調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用及其作用機(jī)制；
　　3.研究AMPK調(diào)控組蛋白翻譯后修飾，如H2B K120ub，H2B S112GlcNAc的機(jī)制及AMPK修飾OGT的具體機(jī)制及對(duì)OGT亞細(xì)胞定位，生物學(xué)功能的影響;
　　4.探

2、索OGT反饋性修飾AMPK機(jī)制及其對(duì)AMPK激活的影響；
　　方法：
　　1.用不同濃度的metformin處理T47D細(xì)胞株24小時(shí)或者用同一濃度(8mM)處理T47D細(xì)胞不同時(shí)間，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)metformin對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期變化情況。同時(shí)用Western檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AMPK的激活情況及組蛋白H2B120位的單泛素化修飾及下游基因的轉(zhuǎn)錄水平。用siRNA特異敲低AMPKa1,檢測(cè)metfor

3、min對(duì)于T47D細(xì)胞的抑制作用是否依賴于AMPK。
　　2.用不同的AMPK的激活劑和抑制劑刺激腫瘤細(xì)胞，AMPK-/-或AMPK+/+MEF細(xì)胞觀察H2B K120ub，H2B S112GlcNAc的水平變化，明確AMPK在H2B K120ub，H2B S112GlcNAc的作用；
　　3.采用質(zhì)譜學(xué)方法，免疫共沉淀方法，體外激酶實(shí)驗(yàn)，放射自顯影等方法明確AMPK與OGT的相互作用關(guān)系，并確定AMPK磷酸化OGT的位點(diǎn)并

4、證實(shí)AMPK對(duì)OGT的磷酸化與否決定了AMPK是否調(diào)節(jié)H2B K120ub，H2B S112GlcNAc的水平變化；
　　4.通過(guò)體外糖基化反應(yīng)，染色質(zhì)抽提，ChIP-qPCR等方法證實(shí)AMPK磷酸化修飾OGT影響了OGT的亞細(xì)胞定位但并不影響OGT的糖基轉(zhuǎn)移酶活性，而OGT同樣可以反饋性的糖基化修飾AMPK并影響其激酶活性，同時(shí)通過(guò)油紅O染色來(lái)觀察OGT糖基化修飾AMPK后對(duì)AMPK下游成脂代謝的影響；
　　結(jié)果：

5、　　1. Metformin處理可以抑制H2B K120ub的水平，并呈AMPK依賴性，AMPK可以抑制H2B S112O-Glc，H2B K120ub及其下游基因轉(zhuǎn)錄；
　　2. AMPK與OGT相互作用，并磷酸化修飾OGT，修飾位點(diǎn)為T(mén)444；
　　3. AMPK通過(guò)磷酸化修飾OGT抑制了染色質(zhì)對(duì)OGT的招募，使細(xì)胞核中OGT的水平降低，但并不影響OGT的糖基轉(zhuǎn)移酶活性；
　　4. AMPK通過(guò)磷酸化修飾OGT參與

6、組蛋白的翻譯后修飾并影響其下游基因轉(zhuǎn)錄水平；
　　5. OGT反饋性糖基化修飾AMPK并抑制其激酶活性；
　　結(jié)論：
　　1. Metformin抑制腫瘤生長(zhǎng)的原因包含激活A(yù)MPK后磷酸化修飾OGT，抑制OGT在染色質(zhì)的聚集，從而抑制H2B S112位點(diǎn)糖基化修飾等一系列組蛋白翻譯后修飾，并影響下游基因轉(zhuǎn)錄水平，從而影響腫瘤細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖；
　　2. AMPK磷酸化OGT的位點(diǎn)為T(mén)444，該位點(diǎn)在多數(shù)動(dòng)物中為