利用具備N-糖基化途徑的家蠶細(xì)胞系表達(dá)糖基化蛋白研究.pdf

1、昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)以其效率高、周期短、成本低的優(yōu)點(diǎn)，自其介導(dǎo)的外源基因表達(dá)首次被報道以來，已有近千種外源蛋白在該系統(tǒng)中得以成功表達(dá).設(shè)想如果可以將昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)應(yīng)用于生產(chǎn)、生活和臨床中，必將具有重大現(xiàn)實(shí)意義.但是，隨著研究的深入?yún)s發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)存在一定缺陷，主要表現(xiàn)在昆蟲/昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)往往不具備復(fù)雜的蛋白質(zhì)糖鏈.然而，在翻譯之后可以直接發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)很少，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)需要修飾后才能發(fā)揮其生物學(xué)功能，并且

2、糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最重要的之一.因此對昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的改進(jìn)的關(guān)注點(diǎn)主要集中在了增加其表達(dá)的糖基化蛋白的復(fù)雜程度，使其產(chǎn)生生物功能和活性類似于哺乳動物的糖蛋白。
　　 本研究是在胡嘉彪等獲得的轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞4種糖基轉(zhuǎn)移酶基因的家蠶BmN轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過酶活檢測以及糖基化蛋白表達(dá)和糖型鑒定的方法來驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的功能。在酶活檢測方面，比較了正常BmN細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的beta-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(Ga

3、lT)活性.在糖蛋白表達(dá)和檢測方面，利用正常BmN細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分別表達(dá)糖基化蛋白—人丁酰膽堿酯酶（hBchE），并利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)檢測細(xì)胞總糖糖型，來比較兩種細(xì)胞的差異，以達(dá)到驗(yàn)證其糖基化作用的目的。
　　 結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的含人源性糖?；富虻霓D(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞系，經(jīng)過傳代15代，細(xì)胞系生長良好，狀態(tài)正常，呈梭型，貼壁好，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在紫外光下可見綠色熒光;測定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中