胃癌多藥耐藥相關(guān)蛋白糖基化及磷酸化研究.pdf

1、【背景】
　　胃癌是我國死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)化療是其最主要的治療方式。但在臨床應(yīng)用中，患者往往出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象（MDR），導(dǎo)致化療失敗而最終死亡。雖然針對胃癌多藥耐藥已有大量報(bào)道，但其根本機(jī)制仍未闡明，說明其產(chǎn)生機(jī)制的復(fù)雜性，也提示我們應(yīng)從新的角度進(jìn)行研究。既往研究認(rèn)為，是蛋白表達(dá)水平的改變，引起了化療藥物與靶標(biāo)的作用變化，從而導(dǎo)致耐藥表型產(chǎn)生。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)翻譯后修飾可能也起了重要的作用。
　

2、　糖基化和磷酸化是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥等惡性表型密切相關(guān)，是近年來的研究熱點(diǎn)。大量研究證明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與蛋白質(zhì)糖基化修飾改變關(guān)系密切。一方面，糖基化可以改變蛋白質(zhì)正常的功能、活性及蛋白間相互作用，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及各種惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮著調(diào)節(jié)功能；另一方面，不同類型和階段的腫瘤所表達(dá)的蛋白質(zhì)糖鏈組分具有特異性，使其具有成為腫瘤標(biāo)志物的潛能。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞內(nèi)磷酸化也發(fā)生了重要改變，并發(fā)

3、揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，具體發(fā)生改變的磷酸化蛋白則可作為腫瘤診斷的標(biāo)志物，甚至是治療的靶標(biāo)。
　　但是,目前尚沒有相關(guān)研究來從整體上探討糖基化和磷酸化改變與胃癌多藥耐藥的關(guān)系，臨床上也沒有可用于預(yù)測耐藥，指導(dǎo)個(gè)體化用藥的有效標(biāo)志物。本研究則通過多種蛋白組學(xué)方法從整體上對這一問題進(jìn)行探討。
　　【目的】
　　1、研究胃癌多藥耐藥過程中，蛋白整體糖基化水平的改變，篩選差異蛋白作為候選標(biāo)志物；2、探討胃癌多藥耐藥產(chǎn)生過程中，磷酸

4、化蛋白及相應(yīng)信號通路的改變；3、研究蛋白糖基化改變參與調(diào)解胃癌多藥耐藥的機(jī)制。
　　【方法】
　　1、利用MTT藥敏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證胃癌多藥耐藥細(xì)胞系的耐藥指數(shù)；2、運(yùn)用糖蛋白質(zhì)譜技術(shù)檢測鑒定細(xì)胞模型中總糖蛋白，分析整體糖基化水平；3、通過細(xì)胞表面糖蛋白捕獲策略檢測鑒定細(xì)胞模型中膜糖蛋白變化情況，篩選差異表達(dá)糖蛋白；4、通過基因重組方法構(gòu)建多藥耐藥蛋白1（MDR-1）的正義表達(dá)載體和定點(diǎn)突變載體；5、運(yùn)用MTT藥敏實(shí)驗(yàn)和多藥耐藥相關(guān)

5、分子生物學(xué)檢測技術(shù)，研究糖基化對MDR-1調(diào)節(jié)耐藥功能的影響及機(jī)制；6、運(yùn)用磷酸蛋白質(zhì)譜技術(shù)檢測鑒定細(xì)胞模型中總磷酸化蛋白表達(dá)差異變化情況，篩選差異表達(dá)磷酸化蛋白；7、通過生物信息學(xué)分析差異磷酸化蛋白參與的信號通路。
　　【結(jié)果】
　　1、SGC7901/VCR和SGC7901/ADR是良好的胃癌多藥耐藥研究細(xì)胞模型。
　　我們首先用MTT藥敏實(shí)驗(yàn)檢測了兩株胃癌耐藥細(xì)胞系與親本細(xì)胞分別對其誘導(dǎo)化療藥物的藥物敏感性。結(jié)果

6、發(fā)現(xiàn)SGC7901細(xì)胞對VCR的IC50值為0.57±0.13μg/ml，對ADR的IC50值為0.14±0.06μg/ml，而SGC7901/VCR細(xì)胞對VCR藥物的IC50值為31.23±0.62μg/ml，SGC7901/ADR細(xì)胞對ADR藥物的IC50值為1.62±0.29μg/ml。與親本細(xì)胞SGC7901相比，兩株耐藥細(xì)胞的耐藥指數(shù)分別上升了55倍和11倍。
　　隨后，我們又檢測了兩株耐藥細(xì)胞系對不同種類化療藥物的藥物

7、敏感性。結(jié)果顯示，兩株耐藥細(xì)胞系除了對各自誘導(dǎo)藥物耐受外，還對CDDP和5-Fu等多種藥物耐受，其耐藥指數(shù)明顯上升。因此，我們認(rèn)為SGC7901/VCR和SGC7901/ADR細(xì)胞系是研究胃癌多藥耐藥的良好細(xì)胞模型。
　　2、胃癌耐藥細(xì)胞中蛋白整體糖基化上升。
　　通過糖蛋白質(zhì)譜技術(shù),我們在胃癌耐藥細(xì)胞系和親本細(xì)胞系中共檢測鑒定到67個(gè)糖蛋白,并得到這些蛋白的糖基化信息及蛋白相對表達(dá)水平數(shù)據(jù)。通過對比分析，大部分糖蛋白在胃癌

8、耐藥細(xì)胞系中糖基化水平上升，說明胃癌細(xì)胞在耐藥性產(chǎn)生的過程中，蛋白整體糖基化水平上升；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的糖基化調(diào)控酶類表達(dá)水平發(fā)生變化，即糖基轉(zhuǎn)移酶UGT1表達(dá)水平明顯上調(diào)，而甘露糖苷Laman表達(dá)則明顯下調(diào)。提示在胃癌化療中，藥物誘導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT1表達(dá)上調(diào)和糖苷酶Laman表達(dá)下調(diào)，二者共同上調(diào)耐藥細(xì)胞蛋白整體糖基化水平。糖基化通過改變蛋白質(zhì)功能，參與了多種細(xì)胞內(nèi)信號通路和生理病理過程的調(diào)節(jié)，使胃癌細(xì)胞能夠逃避化療藥物的殺傷得以

9、存活，最終導(dǎo)致了多藥耐藥表型的產(chǎn)生。
　　3、篩選得到11個(gè)差異蛋白作為可能的胃癌多藥耐藥標(biāo)志物。
　　通過細(xì)胞表面糖蛋白捕獲策略，我們最終檢測鑒定到67個(gè)糖蛋白，其中有56個(gè)(83.6％)為細(xì)胞表面膜蛋白，說明本研究策略具有良好的膜蛋白捕獲效率。隨后GeneOntology分析顯示56個(gè)糖蛋白參與了細(xì)胞凋亡、周期、轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞生理病理活動，而這些活動在胃癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的過程中均發(fā)揮了重要的作用，提示該結(jié)果用于胃癌多

10、藥耐藥研究具有很好的可靠的參考價(jià)值。同時(shí)，以變化超過2倍為界值，我們共篩選得到11個(gè)在耐藥細(xì)胞系中表達(dá)明顯變化的糖蛋白，其中8個(gè)表達(dá)降低，3個(gè)表達(dá)升高。由于這11個(gè)蛋白在兩株多藥耐藥細(xì)胞系中具有一致的變化趨勢，因此與胃癌多藥耐藥惡性表型的相關(guān)性更好，具有良好的成為預(yù)測胃癌多藥耐藥標(biāo)志物的可能性。
　　4、通過WesternBlot驗(yàn)證差異糖蛋白表達(dá)，結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果一致。
　　在11個(gè)差異蛋白中，我們選取了多藥耐藥蛋白1（P-

11、gp）和表皮生長因子受體（EGFR）進(jìn)行Westernblot驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞SGC7901種，P-gp表達(dá)水平較低，主要以非糖基化形式存在（分子量約為130KDa），而在兩株耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中，P-gp則主要以糖基化形式存在（分子量約為170KDa），且表達(dá)水平顯著增高，提示P-gp可能以糖基化形式參與胃癌多藥耐藥過程的調(diào)節(jié)；而EGFR的Westernblot結(jié)果顯示，無論是耐藥細(xì)胞還

12、是親本細(xì)胞系中，EGFR的分子量均為170KDa，亦即以糖基化修飾后形式存在，但在耐藥細(xì)胞系中其表達(dá)水平顯著低于親本細(xì)胞，提示胃癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性過程中，EGFR相應(yīng)的信號通路可能受到抑制。這兩個(gè)蛋白的Westernblot結(jié)果與質(zhì)譜得到的結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了質(zhì)譜分析方法及所得結(jié)果的可靠性。
　　5、糖基化明顯上調(diào)P-gp促胃癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的能力。
　　我們構(gòu)建了P-gp的正義表達(dá)載體和定點(diǎn)突變載體，通過測序和轉(zhuǎn)染細(xì)胞后

13、WesternBlot驗(yàn)證載體構(gòu)建成功；將不同載體及對照載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901后進(jìn)行體外MTT藥敏實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)突變的P-gp蛋白可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對VCR藥物的耐受能力，對其它藥物無明顯影響，但是野生型的P-gp蛋白則可以更加顯著的增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對多種化療藥物的耐受性。這可能是由于突變的P-gp蛋白序列改變，無法經(jīng)糖基化修飾，導(dǎo)致雖然非糖基化形式P-gp（分子量約為140KDa）表達(dá)同樣升高，但其促進(jìn)胃癌耐藥的能力較弱，而只有經(jīng)糖

14、基化修飾的野生型的P-gp蛋白（分子量約為170KDa）才具有成熟的藥物泵功能，促進(jìn)胃癌對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，說明糖基化修飾在P-gp促進(jìn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥表型產(chǎn)生的過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　6、多藥耐藥相關(guān)磷酸化蛋白篩選及生物信息學(xué)分析。
　　通過磷酸化蛋白組學(xué)研究策略，我們在胃癌耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞系中共檢測鑒定到414個(gè)磷酸化蛋白，同時(shí)，以變化超過2倍為界值，我們共篩選得到93個(gè)在耐藥細(xì)胞系中表達(dá)明顯變化的糖蛋白，

15、其中有55個(gè)蛋白在兩株耐藥細(xì)胞系中表達(dá)同時(shí)升高，而有30個(gè)蛋白的表達(dá)均降低，其余8個(gè)蛋白僅在SGC7901/VCR或SGC7901/ADR中表達(dá)升高，提示這8個(gè)蛋白可能是不同化療藥物處理的結(jié)果，而85個(gè)在耐藥細(xì)胞系中變化趨勢一致的蛋白則可以更好的反映胃癌產(chǎn)生多藥耐藥過程中蛋白磷酸化及信號通路的改變。生物信息學(xué)分析顯示，93個(gè)差異蛋白參與了NF-κB、PI3K/Akt、TGFβ、TNF等信號通路的調(diào)控，主要調(diào)節(jié)胃腸道腫瘤的各種生理病理過程