DNA指紋圖譜技術(shù)和克隆文庫分析方法在微生態(tài)制劑質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、微生態(tài)制劑又叫微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，是由調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)、保持微生態(tài)平衡、提高宿主(人或動(dòng)物)健康水平或增進(jìn)健康狀況的益生菌極其代謝產(chǎn)物和促進(jìn)物質(zhì)組成的制劑。此外，在農(nóng)業(yè)中廣泛使用的微生物肥料也屬于微生態(tài)制劑。目前國(guó)內(nèi)對(duì)微生態(tài)制劑質(zhì)量檢測(cè)主要依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和顯微鏡觀察技術(shù)。本研究以微生物肥料和酸奶為研究對(duì)象，嘗試用DNA指紋圖譜技術(shù)和克隆文庫分析方法來對(duì)微生態(tài)制劑的微生物組成進(jìn)行檢測(cè)，以期建立一種新的、快速的微生態(tài)制劑質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)新方法。

2、本論文主要包括以下兩個(gè)方面: １、用DNA指紋圖譜技術(shù)結(jié)合克隆文庫分析方法對(duì)微生物肥料質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè) 微生物肥料中的微生物組成及其穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)微生物肥料質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。由于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)無法對(duì)微生物肥料的菌種組成及其穩(wěn)定性做出全面客觀的評(píng)價(jià)，本研究嘗試用分子生態(tài)學(xué)方法結(jié)合分離培養(yǎng)技術(shù)解決這一問題。本文應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)某微生物肥料的質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行了跟蹤監(jiān)測(cè)，并結(jié)合分離培養(yǎng)和克隆文庫分析方法對(duì)其菌種組成進(jìn)行了

3、檢測(cè)。結(jié)果表明，供試樣品同一個(gè)生產(chǎn)批次3個(gè)不同包裝樣品的細(xì)菌和真菌DGGE圖譜相似性為80％~100％，3個(gè)不同生產(chǎn)批次之間DGGE圖譜相似性為80％~88％，表明該微生物肥料的菌種組成的穩(wěn)定性較好。但分離培養(yǎng)和克隆文庫分析結(jié)果顯示樣品的菌種組成與產(chǎn)品標(biāo)簽說明之間存在較大差異。對(duì)于產(chǎn)品標(biāo)注的6種微生物組成，用分離培養(yǎng)方法和克隆文庫均只能檢測(cè)到其中的Lactobacillus。分離培養(yǎng)方法和克隆文庫分析都檢測(cè)到了Lactobacillus

4、、Bacillus和Monascus三個(gè)屬的部分種，克隆文庫分析還檢測(cè)到了Brevibacillus、Psudononas 和 Penicillium屬的部分種，其中Lactobacillus屬在文庫中所占比例最高，達(dá)到77.8％。而這些微生物并未包括在產(chǎn)品說明中，這說明產(chǎn)品生產(chǎn)過程中可能存在一定的污染。本研究表明分離培養(yǎng)技術(shù)和分子生態(tài)學(xué)方法相結(jié)合，可以比較客觀準(zhǔn)確的對(duì)微生物肥料質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估和監(jiān)測(cè)。 2、用DNA指紋圖譜技術(shù)對(duì)酸

5、奶質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè) 酸奶是一種消費(fèi)者喜愛的微生物保健品，國(guó)內(nèi)對(duì)酸奶質(zhì)量的檢測(cè)目前主要依靠分離培養(yǎng)技術(shù)，由于分離培養(yǎng)方法諸多方面的不足，給酸奶質(zhì)量的檢測(cè)和跟蹤監(jiān)測(cè)增加了困難。本研究嘗試用分子生態(tài)學(xué)方法對(duì)酸奶質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，以期建立一種快速準(zhǔn)確的酸奶質(zhì)量跟蹤監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)的新方法。本節(jié)用PCR-DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis,變性梯度凝膠電泳）指紋圖譜技術(shù)對(duì)市售某品牌酸奶在一個(gè)月內(nèi)進(jìn)行了

6、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，首先收集了6個(gè)生產(chǎn)批次的18個(gè)酸奶樣品，建立了DNA提取、DGGE分析、DGGE圖譜條帶割膠回收測(cè)序等一套完整的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法，通過比較不同樣品DGGE圖譜以及對(duì)DGGE條帶的割膠回收測(cè)序等對(duì)樣品微生物組成及其穩(wěn)定性進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。測(cè)序結(jié)果顯示，供試樣品微生物組成與廠家標(biāo)注完全一致，且沒有檢測(cè)到雜菌污染。同時(shí)，根據(jù)樣品DGGE指紋圖譜分析結(jié)果，在整個(gè)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)期內(nèi)樣品微生物組成比較穩(wěn)定。此外，本章內(nèi)容還包括了另外3個(gè)生產(chǎn)批次的9個(gè)酸

7、奶樣品的研究，主要采用ERIC(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus, 腸桿菌基因間保守重復(fù)序列)-PCR和PCR-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis,變性梯度凝膠電泳)指紋圖譜技術(shù)對(duì)其菌種組成及其穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。ERIC-PCR指紋圖譜聚類分析結(jié)果顯示，同一生產(chǎn)批次內(nèi)3個(gè)不同包裝的樣品ERIC-PCR指紋圖譜相似性為90％左

8、右，而不同生產(chǎn)批次樣品之間ERIC-PCR指紋圖譜相似有所下降，為82％。該結(jié)果進(jìn)一步用DGGE指紋圖譜得到證實(shí)。DGGE分析結(jié)果表明，G2樣品明顯缺少一條主帶，經(jīng)割膠回收測(cè)序發(fā)現(xiàn)這條主帶代表的微生物是Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus，說明該產(chǎn)品不同生產(chǎn)批次間的穩(wěn)定性不是很好。DGGE圖譜和測(cè)序結(jié)果還顯示，除G2樣品外，該酸奶樣品的菌種組成與產(chǎn)品標(biāo)簽說明是一致的。本研究用菌種組成及其