山茱萸DNA指紋圖譜的構(gòu)建.pdf

1、中藥指紋圖譜是指中藥原藥材,飲片,半成品,成品等供試品經(jīng)適當(dāng)處理后,采用一定的分析手段,得到的能夠標(biāo)示其特性的共有峰的圖譜。其特征是整體性和模糊性。以同樣定量取樣、定量操作得到的樣品藥材圖譜,與共有峰指紋圖譜相比較達(dá)到鑒別真?zhèn)魏团袛嘀谐伤幣伍g質(zhì)量是否統(tǒng)一的目的。中藥指紋圖譜已成為國(guó)際上公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的評(píng)價(jià)模式。中藥指紋圖譜包括中藥化學(xué)指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜。其中,DNA指紋圖譜作為中藥生物指紋圖譜的一種,已經(jīng)成為對(duì)中

2、藥進(jìn)行分子遺傳標(biāo)記鑒定的首選方法。山茱萸為常用中藥之一,系山茱萸科植物山茱萸Comus officinalissieb.et Zucc.的干燥成熟果肉,具有補(bǔ)益肝腎,澀精固脫的功效,也是六味地黃丸的主藥。經(jīng)文獻(xiàn)[1]報(bào)道,中國(guó)藥典和部頒標(biāo)準(zhǔn)收載的含山茱萸藥材的中藥復(fù)方制劑共計(jì)70余種,山茱萸藥材的質(zhì)量直接影響到藥效發(fā)揮,故有必要對(duì)山茱萸的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。本實(shí)驗(yàn)鑒于山茱萸藥材的重要性和DNA指紋圖譜的國(guó)際認(rèn)可度,以隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(

3、random amplified polymorphic DNA,RAPD)技術(shù)為研究手段構(gòu)建山茱萸DNA指紋圖譜。
　　 本研究通過文獻(xiàn)查找山茱萸不同果型和產(chǎn)地,優(yōu)化采集和處理山茱萸果實(shí)的條件。采用改良CTAB法提取其基因組DNA,測(cè)定純度。三因素三水平[L9(33)]正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化RAPD反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,然后用三個(gè)單株的山茱萸種質(zhì)篩選100個(gè)隨機(jī)引物,其中重復(fù)性好,多態(tài)性豐富的隨機(jī)引物進(jìn)行全部樣品的RAPD擴(kuò)增,瓊脂糖

4、凝膠電泳檢測(cè)。Phoretix1D軟件進(jìn)行圖譜轉(zhuǎn)化,定性和定量測(cè)定,形成進(jìn)化樹,最終構(gòu)建山茱萸DNA指紋圖譜。采集山茱萸鄰近科植物,分別為山茱萸科毛株,傘形科白芷和野胡蘿卜,五加科常春藤作對(duì)照,與山茱萸不同品種形成進(jìn)化樹,測(cè)量遺傳距離,檢驗(yàn)DNA指紋圖譜構(gòu)建過程。結(jié)果顯示,在25μL的RAPD反應(yīng)體系中各因素的最佳濃度分別為1.925 mmol/L Mg2+0.275 mmol/L dNTPs、0.55μ mol/L引物,DNA模板40

5、 ng和1 U TaqDNA聚合酶:由于引物Tm不同,最佳退火溫度分別為35℃,38℃。在最優(yōu)反應(yīng)條件下,對(duì)100種隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增,其中93種隨機(jī)引物均擴(kuò)增出條帶。引物I1,I2,G4,G1,FA,E3,E2,A2,I2,H4,13,T3和T2可將14種山茱萸種質(zhì)鑒別開。遺傳距離和進(jìn)化樹結(jié)果顯示:白芷(B),常春藤(C),野胡蘿卜(YH)與山茱萸遺傳距離遠(yuǎn);鄭州產(chǎn)山茱萸SZ(橢圓形)和SM(紡錘型)聚在一起;濟(jì)源產(chǎn)山茱萸CY-