廣東道地藥材廣藿香的GC-MS化學指紋圖譜和DNA指紋圖譜研究.pdf

1、目的：廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.，別名刺蕊草、藿香，為藥材和香料兼用的植物，隸屬于唇形科(Lamiaceae)刺蕊草屬(Pogostemon)。廣藿香的干燥地上部分是其藥用部位，味辛，微溫，歸脾、胃、肺三經，具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑的功能，用于濕濁中阻，脘痞嘔吐，暑濕倦怠，胸悶不舒，寒濕閉暑，腹痛吐瀉，鼻淵頭痛，是治療暑濕感冒的良藥，并且是30多種中成藥的組分之一。廣藿香原產東南亞菲律賓

2、、馬來西亞、印度等國家，自宋代傳入我國嶺南地區(qū)，目前在廣東省的廣州郊區(qū)、肇慶地區(qū)、湛江地區(qū)、廣西以及海南島、福建、臺灣等地均有栽培。根據產地的劃分，廣藿香藥材的商品分為牌香(石牌藿香，廣州產)、肇香(肇慶產)、湛香(湛江產)和南香(海南產)。不同產地的廣藿香在形態(tài)和其它性狀上都具有顯著的差別，此外，傳統認為前兩者是道地藥材，質量優(yōu)，供藥用，后兩者質量較次，不供藥用，僅用作提取廣藿香油。廣藿香自引入我國以來，形態(tài)上發(fā)生了很大的變異，隨著廣

3、州城市化的不斷擴建，“石牌藿香”已經出現瀕危的局面，為了拯救優(yōu)良品種，使其得到可持續(xù)性發(fā)展，本研究以不同產地的23個廣藿香樣本作為研究對象，采用分子標記技術和化學分析手段相結合的方法，明確廣藿香的分子特征和化學特征，從而為鑒別廣藿香的真?zhèn)我约暗赖匦耘卸ㄌ峁┛煽康囊罁閺V藿香的種質評價體系提供合理的技術平臺和科學依據。 方法：研究內容分為四個部分：(1)首次采用加壓溶劑提取技術(pressurized liquid extra

4、ction，PLE)提取不同產地的18個廣藿香樣品中的化學成分，并運用GC-MS方法對其進行分析和測定。(2)基于18個樣品的特征峰，進行分級聚類分析，將18個樣品分為不同的化學型并通過計算機輔助相似性評價系統對三個類型進行了相似性的評價，建立了不同產地廣藿香的指紋圖譜。(3)選取30條隨機引物對不同產地的23個廣藿香樣本進行RAPD指紋圖譜分析，并將同屬另外兩種植物長苞刺蕊草【P.chinensis C．Y. Wu et Y.C．Hu

5、ang，PCH】和水珍珠菜【Pogostemon auricularius (Linn.)Hassk.，PAU】作為外類群參與比較。優(yōu)化RAPD條件后，從30條隨機引物中選出5條多態(tài)性高、重復性好的引物S42、S43、S224、S227和OPC-19對不同樣本進行檢測，并根據條帶的差異進行聚類分析，構建不同產地廣藿香的RAPD指紋圖譜。(4)對不同產地的廣藿香進行DNA序列分析研究，選取廣藿香的18S rRNA、matK基因、ITS和5

6、S非轉錄間隔區(qū)共四段序列進行檢測，并通過對各樣品進行聚類分析，考察其基因型和地理型相關性。 結果： (1)從廣藿香中提取分離兩個化合物廣藿香醇和廣藿香酮，并運用GC-MS方法對不同產地的廣藿香樣品進行分析和鑒定，確定包括廣藿香醇和廣藿香酮在內的10個特征性成分：β-廣藿香萜烯、反-丁香烯、α-愈創(chuàng)木烯、刺蕊草烯、β-愈創(chuàng)木烯、б-愈創(chuàng)木烯、廣藿香烯醇、廣藿香醇、環(huán)賽車烯和廣藿香酮。結果表明不同產地的廣藿香中各化學成分的種類和含量

7、具有明顯的差異。PLE和GC-MS的聯合運用具有簡單、快速、靈敏度高的優(yōu)點。(2)基于18個樣品的10個特征峰的聚類分析，可將18個樣品分為三個類型：廣藿香醇型、廣藿香酮性以及基于兩者之間的過渡型。通過計算機輔助相似性評價系統對三個類型進行了相似性的評價，建立了不同產地廣藿香的GC-MS指紋圖譜。指紋圖譜的建立有助于區(qū)分廣藿香的替代品和偽品，也有助于對國內不同地區(qū)的廣藿香進行評價。(3)不同產地廣藿香的RAPD指紋圖譜研究表明，長苞刺蕊

8、草和水珍珠菜的RAPD條帶與廣藿香相比具有明顯的差異，不同產地的廣藿香的RAPD標記也具有較明顯的差異。將不同產地的廣藿香進行聚類分析，同屬種間的PCH和PAU與廣藿香各樣品的相似系數較低，多數情況下聚為獨立的一組；廣藿香樣品G2、G3、G5、G19、G20、G21、G22、G23、G24、G26、G27、G28、G29、G30、G31和G32聚在一起；G8、G9、G10、G11、G12、G13和G16聚在一起。(4)對廣藿香的18S

9、rRNA、matK基因、ITS和5S非轉錄間隔區(qū)共四段序列進行檢測，結果表明，不同產地的廣藿香各段序列具有位點的變異。其中18S rRNA基因各樣品長1809bp，第680位出現A和C的轉換；matK基因序列長1216bp，有15個不同的堿基位點，分別位于第51、57、506、595、636、639、676、721、722、1158、1161、1198、1199、1214和1216位；ITS區(qū)序列(包含部分18S rRNlA、5.8S

10、rRNA和26S rRNA部分序列)總長度為824或825bp，共有不同堿基位點20個，其中ITS1區(qū)有18個，ITS2區(qū)有2個，20個差異位點分別是第38、52、79、82、157、199、205、222、224、251、291、292、373、392、405、415、437、469、520和669位；各樣品的5S間隔區(qū)測得215個堿基，序列完全一致。通過對各樣品進行聚類分析，發(fā)現其基因型和地理型具有顯著的相關性：相同產地的樣品遺傳距

11、離更接近，優(yōu)先聚在一起；產地相近的樣品聚在相近的組中，如廣州和高要地區(qū)的樣品，雷州和遂溪的樣品，徐聞和海南的樣品，相近的程度更高；組培苗樣品在各段基因的比較中都聚為一組，并且和G5相聚，推測其親代的組織來源于G5型植株。 結論：本文應用化學分析手段GC-MS分析技術，并借助分子生物學的平臺——采用RAPD指紋圖譜檢測和DNA直接測序這兩種分子標記技術，多角度闡明了不同產地廣藿香的內在特征。本研究共采集不同產地的廣藿香樣本23個，

12、其中屬于廣州郊區(qū)龍洞的樣本有5個(G19、G29、G30、G31、G32)，蘿崗的樣本6個(G5、G20、G2l、G22、G23、G24)，廣東高要的樣本4個(G2、G3、G27、G28)，廣東吳川的樣本2個(G16、G26)，廣東遂溪的2個(G10、G11)，廣東雷州的2個(G8、G9)，廣東徐聞的1個(G13)，海南的樣本1個(G12)。首次采用加壓溶劑提取技術(PLE)和GC-MS綜合應用，從不同產地的廣藿香樣品中共計分離并鑒定了

13、10個化合物：B-廣藿香萜烯、反-丁香烯、α-愈創(chuàng)木烯、刺蕊草烯、β-愈創(chuàng)木烯、б-愈創(chuàng)木烯、廣藿香烯醇、廣藿香醇、環(huán)賽車烯和廣藿香酮?；?8個樣品的10個特征峰的聚類分析，將18個樣品分為三個類型：廣藿香醇型、廣藿香酮性以及基于兩者之間的過渡型。并通過計算機輔助相似性評價系統對三個類型進行了相似性的評價，建立了指紋圖譜。指紋圖譜的建立有助于區(qū)分廣藿香的替代品和偽品，也有助于對國內不同地區(qū)的廣藿香進行評價。 不同產地的廣藿香的

14、RAPD標記具有明顯的差異，其基因的序列位點也有相應的變化，基因型和地理型具有顯著的相關性；本研究結果表明高要的G2、G3、G27、G28基因型與廣州龍洞的G19、G29、G30、G31、G32更加接近，這與傳統認為的高要地區(qū)的廣藿香質量比較接近“牌香”的說法相一致。除此之外，廣東吳川所產的廣藿香G16、G26也與上述產地的樣品的基因型很接近，這與傳統的說法是有出入的。據我們實地考察發(fā)現，吳川的廣藿香的外在形態(tài)與G19等樣品非常相似，推

15、測是由人為干預種質選擇等因素所造成的。 本研究從多個角度闡明了不同產地廣藿香的化學和分子特征的異同點，首次全面系統的建立了廣藿香的GC-MS化學指紋圖譜庫和DNA指紋圖譜庫，并在此基礎上對不同產地的廣藿香進行了考察和分類，發(fā)現廣藿香的化學型、基因型和地理型三者之間具有顯著的相關性。同時，本研究很大程度上豐富了廣藿香的種質評價體系，為確保廣藿香的藥材質量及其資源的可持續(xù)利用，以及保護瀕危資源石牌藿香提供了科學依據。在今后的工作中，