舒尼替尼在荷腎癌裸鼠體內的時辰藥理學研究.pdf

1、目的：
　　通過皮下接種構造ACHN人腎細胞腺癌移植瘤Balb/c裸鼠模型，探究舒尼替尼（Sunitinib,SU）時辰給藥的藥效學及藥動學特點，并從時辰基因、代謝酶等多個方面探究其可能的藥效作用機制。
　　方法：
　　1.建立裸鼠腎癌模型：將4周齡的Balb/c裸鼠置于嚴格的明暗環(huán)境中適應性飼養(yǎng)兩周，將培養(yǎng)好的ACHN人腎細胞腺癌細胞于裸鼠右上肢皮下注射，建立Balb/c裸鼠移植瘤模型。
　　2.藥效學研究的隨

2、機分組：將裸鼠模型隨機分為4：00、8:00、12:00、16:00、20:00、24:00六個時辰組，每個時辰組又隨機分為舒尼替尼給藥組和模型組。
　　3.藥效學研究的時辰給藥及檢測指標：舒尼替尼給藥組分別在對應的六個時辰點灌胃給予16.25mg·kg-1舒尼替尼溶液0.2mL，模型組則在同樣的時辰點給以等量的CB（Citrate buffer,檸檬酸鹽緩沖液,PH=4.5）。在給藥期間每三天對腫瘤的長短徑進行一次測量以計算其體

3、積，根據其體積變化趨勢繪制出腫瘤體積生長曲線。至第21天則分別于相應時辰點處死裸鼠，剝離瘤體稱重并制作病理切片以比較各組腫瘤的病理形態(tài)。
　　4.藥動學研究的隨機分組：將裸鼠模型隨機分為4:00、8:00、12:00、16:00、20:00、24:00六個時辰組，每個時辰組又分為舒尼替尼給藥組和模型組。每個給藥組包括15 min、30 min、1h、3h、5 h、7 h、9 h、14 h、19 h、24 h共10個取血點。每個時辰

4、組設置正常裸鼠作為空白對照組。
　　5.藥動學研究的時辰給藥及檢測指標：給藥組于六個時辰點分別灌胃給以舒尼替尼16.25mg·kg-1，并于給藥后15 min、30 min、1h、3h、5 h、7 h、9 h、14 h、19 h、24 h摘眼球取血0.5mL，離心取血漿置-80℃保存，采用HPLC-MS/MS（high-performance liquid chromatography coupled with tandem ma

5、ss spectrometry,高效液相色譜法聯合質譜）的方法測定不同時辰點舒尼替尼及其主要活性代謝物 N-去乙基舒尼替尼（SU12662）的血藥濃度，并用WinNonlin6.3計算各時辰點的藥動學參數。取血后迅速處死裸鼠，并立即取肝臟于-80℃冷凍保存。
　　6.相關基因表達水平的檢測：從肝組織中提取總 RNA采用qRT-PCR（Quantificational Real Time-PCR,實時熒光定量PCR）檢測cyp3a1

6、1（cytochrome P450 enzyme3a11,細胞色素P450酶3a11）、cyp3a13、Bmal-1（brain and muscle arnt-like protein-1,時辰基因編碼芳香烴受體核轉運樣蛋白）、Clock（circadian locomotor output cycles kaput,生物鐘循環(huán)輸出蛋白）及時辰基因的作用位點Dbp（D site-binding protein，D-位點結合蛋白）的表達

7、。
　　結果：
　　1.舒尼替尼在荷瘤裸鼠體內的時辰藥效學具有晝夜節(jié)律性，與模型組相比，各時辰給藥組的腫瘤體積增長速度均有所減慢，腫瘤重量也有不同的減輕。16:00組的腫瘤生長曲線坡勢陡直，與其他五個給藥組相較，腫瘤體積增長迅速，抑瘤率最低；8:00、12:00給藥組與16:00及20:00給藥組相比，腫瘤體積生長緩慢，抑瘤率高，有顯著性差異（p<0.05），其中8:00給藥組腫瘤受抑制情況最為明顯。病理切片結果顯示，16:

8、00及20:00給藥組腫瘤組織細胞排列基本無間隙，邊界較為清楚，腫瘤壞死量少，炎性細胞浸潤情況輕微；8:00及12:00給藥組中大量的腫瘤細胞是壞死的，表現出嚴重的炎性細胞浸潤和血管破裂出血。
　　2.舒尼替尼在荷瘤裸鼠體內的時辰藥動學具有晝夜節(jié)律性，相比其他各時辰給藥組，16:00與20:00給藥組AUC0-24h較低，清除率高；8:00及12:00給藥組裸鼠體內總藥物具有更高的AUC0-24h、MRT0-24h和更低的CL/F

9、，在體內駐留時間長，血藥濃度高，與16:00給藥組相比具有統(tǒng)計學差異（p<0.05）。與藥效學研究結果相一致。
　　3.代謝酶基因 cyp3a11、cyp3a13及時辰基因 Bmal-1、Clock、Dbp在荷腎癌裸鼠肝臟組織中的表達顯示出顯著的晝夜節(jié)律性。模型組代謝酶基因cyp3a11、時辰基因Bmal-1在12:00至20:00時間范圍內表達量高，在16:00表達最高，達到峰值； cyp3a13及 Clock表達量自8:00起

10、呈現不斷上升的趨勢，在20:00至24:00時間段內坡度最大，增長速率最為迅速。結合位點蛋白Dbp在16:00、24:00均有較高程度的表達。在不同的時間點給予舒尼替尼后，16:00組Bmal-1、cyp3a11總體表達量最高；24:00組Clock、Dbp及cyp3a13總體表達量最高，其中Clock及cyp3a13在20:00組也有較高的表達。時辰基因與代謝酶基因的整體表達趨勢具有一致性。
　　結論：
　　舒尼替尼在荷瘤