舒尼替尼對食管癌細胞的功能及其血管生成擬態(tài)的影響.pdf

1、背景與目的:
　　食管癌為世界最多見的消化系惡性腫瘤之一。我國為食管癌的高發(fā)地區(qū)，食管癌的發(fā)病率高居全國各種惡性腫瘤的前5位。食管癌的早期表現(xiàn)不明顯,確診時大多已進入中晚期,以手術(shù)為主的綜合治療已成為全球共識,能手術(shù)切除者的5年生存率在30％左右，食管癌在治療中的早期轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是造成其死亡率較高的重要原因。然而現(xiàn)在食管癌的治療結(jié)局很不讓人滿意，因此必須要找尋更優(yōu)的治療方案。
　　舒尼替尼（sunitinib）為口服的高選

2、擇性多靶點小分子蛋白激酶抑制劑,能抑制多種信號通路的正常進行,而且它還有抗腫瘤血管生成和抗腫瘤細胞增殖的生物學(xué)活性。它能抑制多種酪氨酸激酶受體，其中就有血管內(nèi)皮生長因子受體( VEGFR)、FNS樣酪氨酸激酶(FLT3)、抑制干細胞生長因子受體( KIT),血小板衍生生長因子受體( PDGFR)等多種酪氨酸激酶受體。
　　血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicryVM)是近年來在某些惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的一種獨立于傳統(tǒng)腫瘤血

3、管生成的全新腫瘤微循環(huán)模式，前期實驗發(fā)現(xiàn)食管癌細胞株中存在VM現(xiàn)象，并出現(xiàn)相關(guān)基因的高表達。本研究用sunitinib作用兩種食管鱗狀細胞癌細胞系KYSE70（低分化鱗癌）和KYSE450（高分化鱗癌），觀察其對高、低分化不同的食管鱗癌細胞增殖、遷移和 VM形成的影響及其不同等，為進一步研究sunitinib在食管鱗癌治療中的應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1．用含青霉素（常用濃度是25~100ui/ml）與鏈霉素（25

4、~100μg/ml）且含10%滅活胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)食管癌細胞系KYSE70和KYSE450。
　　2．應(yīng)用MTT法檢測不同濃度（1.50、3.00、6.00、12.00、24.00μmol/L）的sunitinib不同作用時間（24、48、72h）對兩種不同細胞的增殖抑制作用。
　　3．流式細胞術(shù)檢測不同濃度（3、6、12μmol/L）的舒尼替尼作用于兩種細胞后細胞的凋亡情況的變化。
　　4

5、．三維培養(yǎng)是利用基質(zhì)膠制成三維培養(yǎng)體系模擬人體內(nèi)環(huán)境，并在此環(huán)境中培養(yǎng)人食管癌鱗狀細胞KYSE70和KYSE450，再放于熒光倒置顯微鏡下來觀察各實驗組的管道結(jié)構(gòu)形成的形態(tài)及數(shù)量及其變化情況。
　　5．RT-PCR檢測藥物作用前后各組細胞VM相關(guān)分子c-Met、mek、VE-cad和MMP-2基因mRNA的表達的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1．MTT結(jié)果顯示：舒尼替尼抑制KYSE450和KYSE70細胞系的增殖，且隨著

6、舒尼替尼濃度的增高兩種細胞抑制作用也越明顯，根據(jù)不同時間點對抑制率的測定在72小時時抑制率最高，且抑制作用隨時間和濃度的增加而增大，差異在統(tǒng)計學(xué)上有意義（P＜0.05），而兩實驗組之間差異不大（P=0.056）。
　　2．流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：（1）3、6、12μmol/Lsunitib分別作用于KYSE70細胞和 KYSE45048h小時后，細胞凋亡率分別為（33.20±0.91）％、（46.00±1.35）％、（69.00±1.

7、56）％和（35.00±0.21）％、（47.00±0.98）％、（74.30±1.28）％,而對照組細胞凋亡率為（1.30±0.26）％和（1.50±0.34）％。統(tǒng)計分析后顯示，隨著舒尼替尼濃度的增加細胞凋亡率也不斷增大，且呈明顯的濃度依賴性，與空白對照組相比，差異在統(tǒng)計學(xué)有意義（P＜0.05），而兩實驗組之間差異不大（P=0.053）。
　　3．三維培養(yǎng)結(jié)果顯示：約12小時后KYSE70和KYSE450細胞在基質(zhì)膠上均形成典

8、型的血管網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)，呈單個環(huán)狀或多個環(huán)相連的網(wǎng)格狀。Sunitinib作用24小時后，兩種細胞在體外的管道狀結(jié)構(gòu)形成能力皆被明顯的抑制了，環(huán)狀結(jié)構(gòu)斷裂不全，大部分為不完全封閉環(huán)形甚至形成線狀結(jié)構(gòu)，且濃度越大環(huán)狀結(jié)構(gòu)個數(shù)就越少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)；而兩組不同的細胞間相比差異不明顯（P=0.054）。
　　4．RT-PCR結(jié)果顯示：sunitinib作用48小時后c-met，mek，VE-cad，MMP-2 mRNA的

9、表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且C-met與mek下降程度一致，VE-cad與MMP-2下降程度一致；而兩組細胞之間對比無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.06）。
　　結(jié)論:
　　1．舒尼替尼可通過多種通路有效抑制高低分化食管鱗癌細胞中VE-cad和C-met的表達，通過下調(diào)MMP-2和mek等下游信號的表達而抑制血管生成擬態(tài)的形成和其他途徑共同發(fā)揮這抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的效應(yīng)。
　　2．多靶點靶