FoxM1調控DAN損傷修復在慢性髓性白血病伊馬替尼耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是造血干細胞發(fā)生惡性克隆產生的一種疾病，按臨床病程可分為慢性期(Chronic Phase，CP)、加速期(Accelerated Phase，AP)和急變期(Blast Crisis，BC)。一旦進入急變期，預后極差。費城染色體(Ph)和BCR-ABL基因融合是CML的標志性改變。抑制酪氨酸激酶活性的抑制劑伊馬替尼(Imatinib，IM)

2、能夠靶向BCR-ABL融合蛋白，成為目前CML治療的一線藥物。然而，隨著時間的推移，越來越多的CML患者出現(xiàn)IM耐藥，這嚴重制約了CML療效的提高，目前已成為CML靶向治療面臨的主要挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，CML患者IM耐藥的主要原因之一是BCR-ABL基因點突變或擴增導致的酪氨酸激酶活性持續(xù)增高。因此，探索BCR-ABL依賴IM耐藥的機制及其逆轉對策是當前臨床上CML治療關注的焦點。
　　越來越多的證據(jù)顯示，DNA損傷修復對基因組維持完

3、整性和穩(wěn)定性至關重要，其功能異常導致的基因組不穩(wěn)定與CML疾病進展及耐藥性的產生關系密切。研究顯示，阻斷DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)的修復能使CML細胞Mo7e-P210 IMR和Baf3-P210 IMR對IM敏感性增強。另有研究報道，應用小分子抑制劑IBR2下調DNA損傷修復相關基因RAD51的表達，可引起IM耐藥細胞T315I-Ba/F3增殖受抑、凋亡增加，并明顯增強耐藥細胞對IM的敏感

4、性。由此可見，DNA損傷修復在CML細胞IM耐藥中發(fā)揮著重要作用，可能是一種新的IM耐藥機制，闡明其作用機理對克服IM耐藥具有重要意義。
　　近來研究顯示，增殖特異性癌基因FoxM1（Forkhead box protein M1）能夠靶向BRIP1、RAD51、BRCA2等多種DNA損傷修復蛋白，調控DNA損傷修復，在膠質母細胞瘤、乳腺癌等多種腫瘤的化療藥物抵抗中發(fā)揮重要作用。FoxM1可調節(jié)細胞周期相關特異性基因的轉錄，與細胞

5、增殖、組織再生、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復和腫瘤形成密切相關。新近研究證明，F(xiàn)oxM1在乳腺癌等多種腫瘤中過表達，其高表達的腫瘤具有低分化、惡性程度高、易遠處轉移的特點，臨床預后不佳。FoxM1通過調控其下游腫瘤相關基因的表達，影響基因組的穩(wěn)定性及有絲分裂的進程，從而促進腫瘤增長、侵襲和轉移，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用。綜上，F(xiàn)oxM1是腫瘤增殖所必需的轉錄因子，探討其在CML IM耐藥中的作用及機制，可為逆轉IM耐藥帶來全新的治療思

6、路和方案，提供臨床治療的新靶點。
　　研究目的:
　　研究FoxM1在不同臨床分期的CML患者中表達水平，分析FoxM1表達與疾病進展及IM耐藥的關系，探討FoxM1對CML預后的臨床意義;研究干預FoxM1表達對CML細胞生物學行為的影響;闡明FoxM1對DNA損傷修復的調控作用，進一步揭示FoxM1參與IM耐藥的作用機制。
　　研究方法:
　　1.檢測CML患者FoxM1表達，分析其與CML疾病分期和IM耐藥

7、的關系，評價FoxM1分子對CML發(fā)病及預后的臨床意義。
　　1.1標本收集:收集50例CML患者及12例正常對照者骨髓的標本，CML患者分為慢性期(CP)組38例，加速/急變期(AP/BP)組12例，其中初診組19例。使用淋巴細胞分離液采用密度梯度離心法來分離單個核細胞，-80℃凍存。
　　1.2免疫磁珠分選骨髓CD34+及CD34-單個核細胞:骨髓單個核細胞總數(shù)＞1×108的CML患者標本13例及臍帶血標本6例，使用淋巴

8、細胞分離液采用密度梯度離心法來分離出單個核細胞后，留取1×106個細胞，-80℃保存?zhèn)溆?剩余細胞使用CD34+磁珠分選法獲得CD34+及CD34-細胞，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　1.3實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法(Real-time QuantitativePolymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測Fox M1的表達水平:采用TRIzol法提取細胞總RNA，應用PrimeScript RT rea

9、gent試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，SYBR Green法檢測CML患者及正常對照者的單個核細胞、CD34+及CD34-單個核細胞中Fox M1表達情況。
　　2.研究IM耐藥CML細胞株K562/G01及其IM敏感株K562對IM的藥物敏感性、FoxM1表達及DNA損傷修復情況。
　　2.1 CCK8法檢測CML細胞對IM敏感性:配制不同濃度梯度的IM溶液，分別處理IM敏感株K562細胞和IM耐藥株（BCR-ABL過度

10、擴增）K562/G01細胞48小時，CCK8法檢測并計算細胞存活率及IC50值。
　　2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術(FACS)檢測細胞凋亡率:IM分別處理K562細胞和K562/G01細胞48h，AnnexinⅤ-FITC和PI進行雙染細胞，應用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。
　　2.3 Western-blot法檢測K562細胞及K562/G01細胞的FoxM1、BCR-ABL激酶活性蛋白及DNA

11、損傷標志物的表達:細胞總蛋白提取液分別提取K562細胞和K562/G01細胞的總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，檢測FoxM1、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr和P-Crkl及DNA損傷標志物γ-H2AX的表達。
　　2.4免疫熒光法檢測細胞DNA損傷修復情況:同樣濃度的IM處理K562細胞和K562/G01細胞6小時，利用免疫熒光法檢測細胞中DNA損傷標志物γ-H2AX的表達。
　　3.研究干預FoxM1表達對CM

12、L細胞生物學行為的影響。
　　3.1上、下調CML細胞中FoxM1的表達:(1)慢病毒感染細胞:分別應用FoxM1攜帶過表達載體的慢病毒及其過表達對照病毒感染IM敏感細胞株K562;應用攜帶FoxM1干擾片段shRNA的慢病毒及其干擾對照病毒感染IM耐藥細胞株K562/G01。使用嘌呤霉素(puromycin)篩選2周，獲得穩(wěn)定過表達或低表達FoxM1的CML細胞株。(2)利用FoxM1的小分子抑制劑下調CML患者CD34+細胞中

13、FoxM1表達:硫鏈絲菌素(Thiostrepton，TST)、硼替佐米(Bortezomib，BTZ)處理K562/G01細胞及CD34+細胞48小時。
　　3.2 Real-time RT-PCR法檢測干預FoxM1表達后CML細胞的FoxM1及其下游分子的mRNA表達水平。
　　3.3 Western-blot法檢測干預FoxM1表達后CML細胞的FoxM1分子、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr、P-Crkl的表達

14、。
　　3.4 CCK8法研究干預FoxM1表達后CML細胞IM敏感性的改變:配制不同濃度梯度的IM溶液處理各組細胞，48小時后檢測并計算細胞存活率及IC50值。
　　3.5流式細胞術檢測干預FoxM1表達后CML細胞株和原代CD34+細胞的凋亡情況:IM處理各組細胞，48小時后收集細胞，AnnexinⅤ-FITC/PI進行雙染后，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　3.6 Western-blot檢測干預FoxM1

15、表達后CML細胞DNA損傷標志物γ-H2AX的蛋白表達水平;免疫熒光法檢測干預FoxM1表達后CML細胞的DNA損傷修復情況:IM處理各組細胞，利用免疫熒光法檢測細胞中DNA損傷標志物γ-H2AX的表達。
　　4.篩選并鑒定參與CML細胞IM耐藥的FoxM1關鍵下游DNA損傷修復基因。
　　4.1全基因表達譜芯片法:分別收集FoxM1過表達及FoxM1 shRNA慢病毒處理前后的CML細胞，利用基因芯片檢測各組間差異表達的基

16、因，作為FoxM1調控的參與IM耐藥的候選下游DNA損傷修復基因。
　　4.2 Real-time RT-PCR法驗證各候選下游DNA損傷修復基因表達:在FoxM1過表達慢病毒感染前后CML細胞中檢測各候選DNA損傷修復基因的mRNA表達水平。選擇一個表達差異顯著的候選下游基因作為目標下游DNA損傷修復基因。
　　4.3 Western-blot法驗證目標FoxM1目標下游DNA損傷修復基因的表達:細胞總蛋白提取液提取干預F

17、oxM1表達的CML細胞的總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，檢測目標下游DNA損傷修復基因蛋白水平的表達。
　　5.研究FoxM通過調控目標下游DNA損傷修復基因，對CML細胞生物學行為產生的影響。
　　5.1質粒及病毒轉染:應用攜帶目標下游DNA損傷修復基因干擾片段shRNA的慢病毒及其干擾對照病毒感染K562/G01細胞;應用LipofectamineTM2000將攜帶目標下游DNA損傷修復基因過表達載體的質粒及其過

18、表達對照質粒轉染FoxM1低表達的K562/G01細胞（感染攜帶FoxM1干擾片段shRNA慢病毒并穩(wěn)定表達的K562/G01細胞）。嘌呤霉素篩選2周后獲得穩(wěn)定過表達或低表達目標下游DNA損傷修復基因的細胞株及其對照細胞株。
　　5.2 Real-time RT-PCR檢測干預目標下游DNA損傷修復基因后CML細胞中其mRNA表達水平;Western-Blot檢測干預目標下游DNA損傷修復基因后CML細胞中其蛋白表達水平、BCR-

19、ABL激酶活性蛋白P-Tyr。
　　5.3 CCK8法檢測干預目標下游DNA損傷修復基因后CML細胞對IM的敏感性:IM處理各組細胞48小時后，CCK8法檢測并計算細胞的存活率及IC50值。
　　5.4流式細胞術檢測干預目標下游DNA損傷修復基因后CML細胞的凋亡情況:IM處理各組細胞，48小時后收集細胞，AnnexinⅤ-FITC/PI進行雙染后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　5.5 Western-Blot檢測

20、干預目標下游DNA損傷修復基因后CML細胞中DNA損傷標志物γ-H2AX的蛋白表達水平;免疫熒光法檢測干預目標下游DNA損傷修復基因后CML細胞的DNA損傷修復情況:IM處理各組細胞，6小時后應用免疫熒光法檢測各組細胞DNA損傷標志物γ-H2AX蛋白水平的表達。
　　實驗結果
　　1.FoxM1在CML患者及正常對照中的表達。
　　1.1 FoxM1在CML患者與正常對照中的表達:Real-time RT-PCR結果顯

21、示在初診CML患者中FoxM1 mRNA的表達水平顯著高于正常對照組;FoxM1表達與CML患者疾病分期有關，AP/BP組患者的FoxM1表達水平明顯高于CP組患者;FoxM1表達與IM敏感性有關，初診CP患者經IM治療無效后如進展為AP/BC，其FoxM1表達水平呈上升趨勢;初診CP患者經IM治療后若穩(wěn)定于完全緩解階段，其FoxM1表達水平呈下降趨勢。
　　1.2 FoxM1在CML干細胞中的表達:FoxM1 mRNA在CML患

22、者CD34+細胞中的表達水平明顯高于CD34-細胞和正常對照組CD34+細胞;在正常對照組CD34+及CD34-細胞的FoxM1 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。
　　2.所選IM耐藥CML細胞株K562/G01及其敏感株K562對IM的藥物敏感性。
　　2.1 CCK8法顯示IM耐藥株K562/G01細胞對IM的IC50為IM敏感株K562的約40倍。
　　2.2流式細胞術顯示IM處理細胞48h后，K562/G01

23、細胞的凋亡率明顯低于K562細胞。
　　2.3 Western-blot顯示K562/G01細胞中FoxM1、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr和P-Crkl的表達明顯高于K562細胞，DNA損傷標志物γ-H2AX表達明顯低于K562細胞。
　　2.4免疫熒光法顯示K562/G01細胞中DNA損傷標志物γ-H2AX表達明顯低于K562細胞。
　　3.FoxM1調控CML細胞BCR-ABL激酶活性及IM敏感性檢測。

24、r>　　3.1上調IM敏感細胞株K562中FoxM1表達對細胞IM敏感性的影響:Real-time RT-PCR、Western-blot驗證FoxM1 mRNA及蛋白水平上調后，CCK8法顯示細胞存活率升高，IC50值增大;流式細胞術檢測細胞凋亡明顯減少;Western-blot顯示BCR-ABL激酶活性標志P-Tyr、P-Crkl蛋白表達水平升高;Western-blot及免疫熒光顯示DNA損傷標志物γ-H2AX表達水平降低。

25、>　　3.2下調IM耐藥細胞株K562/G01中FoxM1表達對細胞IM敏感性的影響:Real-timeRT-PCR、Western-blot驗證FoxM1的mRNA及蛋白水平下調后，CCK8法顯示細胞存活率降低，IC50值減小;流式細胞術顯示細胞凋亡顯著增加;Western-blot檢測BCR-ABL激酶活性標志P-Tyr、P-Crkl蛋白表達水平降低;Western-blot及免疫熒光顯示DNA損傷標志物γ-H2AX表達水平升高。<

26、br>　　3.3應用FoxM1的小分子抑制劑下調CML患者骨髓CD34+細胞的FoxM1表達對細胞IM敏感性的影響:Annexin-Ⅴ FITC/PI進行雙染，流式細胞術顯示細胞凋亡明顯增加。
　　4.鑒定并選擇參與IM耐藥的FoxM1下游關鍵的DNA損傷修復基因。
　　4.1根據(jù)芯片結果及比較干預FoxM1前后CML細胞中各候選基因mRNA表達水平結果，初步選擇PARP作為FoxM1調控參與IM耐藥的目標下游DNA損傷修復

27、基因。
　　4.2 IM耐藥細胞株K562/G01中下調PARP的表達:Real-time RT-PCR、Western-Blot驗證PARP的mRNA及蛋白表達水平降低;CCK8法顯示細胞存活率降低，IC50值減小;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術顯示細胞凋亡增加;Western-blot、免疫熒光顯示DNA損傷標志物γ-H2AX表達水平升高。
　　4.3 FoxM1低表達的K562/G01細胞中上調PARP

28、的表達:Real-time RT-PCR、Western-Blot驗證PARP的mRNA及蛋白表達水平升高;CCK8法顯示細胞存活率升高，IC50值增大;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術顯示細胞凋亡減少;Western-blot、免疫熒光顯示DNA損傷標志物γ-H2AX表達水平降低。
　　實驗結論
　　1.FoxM1在初診CML患者中明顯高表達，在不同疾病分期及不同IM療效的CML患者中存在明顯差異表達，提示了

29、FoxM1可能參與CML疾病發(fā)生發(fā)展過程，且可能與CML IM耐藥關系密切。
　　2.FoxM1在CML患者CD34+細胞中表達量明顯高于其CD34-細胞和正常對照組CD34+細胞，提示FoxM1在維持CML干細胞的存活和自我更新中起一定的作用。
　　3.FoxM1信號通路可通過促進DNA損傷修復，抑制CML細胞凋亡并增強BCR-ABL激酶活性，從而促進IM耐藥。
　　4.鑒定出PARP是FoxM1調控參與IM耐藥的下