節(jié)點干預(yù)對無尺度細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的影響.pdf

1、目的：建立細胞信號網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法，對細胞信號網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)屬性獲得初步認識，并在此基礎(chǔ)上根據(jù)實驗和計算機仿真技術(shù)分析不同類型的節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的功能地位，進而認識細胞信號網(wǎng)絡(luò)對意外差錯的承受能力，也為進一步的深入研究提供指導(dǎo)。 方法：①細胞信號網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其拓撲結(jié)構(gòu)分析：根據(jù)已知的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生化作用機制，進行復(fù)雜細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建。構(gòu)建主要包括以下三個步驟：確定在輸入刺激條件下能夠產(chǎn)生輸出效應(yīng)(行

2、使一定生理功能)的線性途徑；分析途徑之間發(fā)生相互作用的節(jié)點間的連接關(guān)系，確定不同節(jié)點的連接度；功能模塊的組織及其相互作用。根據(jù)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模型，從節(jié)點的連接度、節(jié)點的組織特征、信號交流和隨機性節(jié)點去除對網(wǎng)絡(luò)的影響等幾個不同的層次分析其拓撲結(jié)構(gòu)屬性。②計算機仿真分析：采用自主開發(fā)的計算機仿真軟件SIMTRAN2.0對上述細胞信號網(wǎng)絡(luò)中的不同類型的節(jié)點分子干擾所致的動力學改變進行仿真分析，仿真時間為120min，步長為0.2min。通過改變相

3、應(yīng)反應(yīng)方程的動力學參數(shù)來模擬節(jié)點遭受的激活性或抑制性攻擊。目標節(jié)點包括高連接度和低連接度兩大類節(jié)點，模擬攻擊范圍包括單個節(jié)點遭受攻擊和多個節(jié)點同時遭受攻擊，攻擊性質(zhì)分為激活性和抑制性兩種。③節(jié)點抑制對小鼠神經(jīng)元信號網(wǎng)絡(luò)影響分析：小鼠神經(jīng)元原代培養(yǎng)7d后，進行干預(yù)處理。實驗共分四組，對照組不加抑制劑，實驗一組加入特異性Ras抑制劑(ManumycinA，M-1025)，實驗二組加入特異性JAK抑制劑(420099)，實驗三組加入特異性PD

4、E抑制劑(RO20-1724)，置于CO2培養(yǎng)箱中(5％CO2、、37℃)孵育過夜。抑制劑作用后，對照組和實驗組均給予EGF(20ng/μl)刺激，分別作用0min、10min、20min、60min、120min，用液氮終止EGF刺激作用。裂解細胞，收集蛋白，考馬斯亮藍G-250法蛋白定量，SDS-PAGE分離蛋白后半干式電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用Phospho-AKT單克隆抗體和Phospo-MEK1/2單克隆抗體結(jié)合持久性化學發(fā)光檢

5、測技術(shù)確定Phospho-AKT、Phospo-MEK1/2的相對強度。 結(jié)果：①通過構(gòu)建得到了一定尺度的復(fù)雜性細胞信號網(wǎng)絡(luò)模型，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的連接度呈高度的不均一性，其中少數(shù)節(jié)點與其它眾多節(jié)點發(fā)生連接，而大多數(shù)節(jié)點只與其它較少節(jié)點發(fā)生連接。②計算機模擬的動力學曲線表明：Ras的持續(xù)性激活導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)輸出改變的強度和范圍遠遠大于一過性過度激活，網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(Ras、PI3K、PKA)的干擾效應(yīng)明顯超過普通節(jié)點(PDE、PAK、PLA

6、2)的干擾效應(yīng)。③多個節(jié)點聯(lián)合干擾所至信號網(wǎng)絡(luò)動力學的改變是極其復(fù)雜的。④Western印跡結(jié)果表明Ras節(jié)點的抑制導(dǎo)致MEK1/2和AKT磷酸化水平明顯改變，而PDE或JAK節(jié)點分別抑制后MEK1/2和AKT磷酸化水平無明顯改變。根據(jù)相對強度曲線可以清晰看到，Ras節(jié)點阻斷后MEK1/2和AKT磷酸化水平分別由62.80％和46.13％降為8.86％和15.32％，而PDE或JAK節(jié)點分別抑制后MEK1/2和AKT磷酸化水平無明顯改變

7、。 結(jié)論：①細胞信號網(wǎng)絡(luò)具有無尺度屬性，其重要節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)的組織、行使功能中起著重要作用。細胞信號網(wǎng)絡(luò)對一定程度內(nèi)的隨機性節(jié)點意外差錯具有驚人的承受能力。②細胞信號網(wǎng)絡(luò)的動力學行為具有明顯的非線性。③重要節(jié)點與普通節(jié)點拓撲結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了其網(wǎng)絡(luò)功能的差異，重要節(jié)點通過直接或間接作用對眾多節(jié)點起著支配作用，而普通節(jié)點則僅僅與少數(shù)節(jié)點相關(guān)聯(lián)。重要節(jié)點的差錯在信號網(wǎng)絡(luò)紊亂中具有重要地位，而普通節(jié)點的差錯對信號網(wǎng)絡(luò)的影響較小。④網(wǎng)絡(luò)中廣