激活態(tài)雪旺細胞信號轉導通路的實驗研究.pdf

1、周圍神經的缺損，尤其是長段周圍神經的缺損的修復是外科領域的一大難題。隨著組織工程材料的不斷發(fā)展和對于組織工程神經認識的不斷深入，使得人工神經的發(fā)展成為一個非常有前景的領域。膠元-幾丁糖有可能作為人工神經支架的良好材料：激活態(tài)雪旺細胞是一種具有高活性、快速增殖的可以顯著促進周圍神經再生的細胞，是組織工程人工神經良好的種子細胞。本課題將要分三個部分研究為何激活態(tài)雪旺細胞有優(yōu)于正常態(tài)雪旺細胞的生物活性? 第一部分 激活態(tài)雪旺細胞信號轉

2、導通路的分子構成 目的 探索激活態(tài)雪旺細胞信號轉導通路的分子構成。方法 用改良成年SD大鼠雪旺細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)激活態(tài)雪旺細胞(ASC)和正常態(tài)雪旺細胞(NSC)，分別用RTK和G蛋白耦聯(lián)的信號轉導通路中的七個抑制劑，Western Blot法檢測細胞內的p-ERK1/2水平的改變，比較激活態(tài)雪旺細胞和正常態(tài)雪旺細胞的信號轉導通路的差異。結果 光鏡下激活態(tài)雪旺細胞和正常態(tài)的雪旺細胞形態(tài)上無差異，S-100染色均為陽性，Western

3、 Bolt法檢測ASC和NSC細胞內的ERK1/2水平無明顯的差異，但ASC內p-ERK1/2水平有顯著差異(p<0.01)。在激活態(tài)雪旺細胞，使用抑制劑CTX、D609和BAPTA-AM細胞內的p-ERK1/2水平顯著降低，而其它抑制劑使用后細胞內的p-ERK1/2水平無明顯的改變，差異具有顯著性(p<0.01)；在正常態(tài)的雪旺細胞，使用抑制劑U73122和BAPTA-AM，細胞內的p-ERK1/2水平顯著降低，而其它抑制劑使用后細胞

4、內的p-ERK1/2水平無明顯的改變，差異具有顯著性(p<0.01)。結論 激活態(tài)雪旺細胞和正常態(tài)雪旺細胞是同一細胞的二種不同存在的狀態(tài)，有活性的p-ERK1/2的水平的升高可能是雪旺細胞激活的關鍵環(huán)節(jié)。激活態(tài)雪旺細胞和正常態(tài)雪旺細胞都是通過G蛋白耦聯(lián)受體信號轉導通路來發(fā)揮生物效應的，但是激活態(tài)雪旺細胞通過PC-PLC分解磷脂酰膽堿使細胞內的DAG水平的提高來發(fā)揮生物效應的，而正常態(tài)雪旺細胞則通過PI-PLC信號轉導通路發(fā)揮其生物效應的

5、。 第二部分 應用轉錄因子蛋白/DNA組合芯片技術檢測激活態(tài)雪旺細胞的活性轉錄因子 目的 檢測激活態(tài)雪旺細胞活性轉錄因子。方法 應用轉錄因子蛋白/DNA組合芯片技術檢測激活態(tài)雪旺細胞的活性轉錄因子。結果 激活態(tài)雪旺細胞和正常態(tài)雪旺細胞的轉錄因子芯片點陣圖顯示：激活態(tài)雪旺細胞比正常態(tài)雪旺細胞有5個轉錄因子蛋白上調2倍以上，它們是AP-1、NRF-1、NF-Atx、PO-B和PRDI-BF：活化的AP-1蛋白的顯著增加可能就

6、是激活態(tài)雪旺細胞增殖活性高重要的原因：NF-Atx表達升高可能是協(xié)同AP-1的轉錄表達；激活態(tài)雪旺細胞可能通過提高NRF1和mtTFA表達，引起線粒體呼吸鏈酶蛋白表達升高，線粒體酶活性升高，從而提高線粒體能量代謝，為激活態(tài)雪旺細胞的高分泌狀態(tài)提供能量，促進激活態(tài)雪旺細胞的增殖；而PO-G不僅作用于它的靶基因，而且還作用于其它的基因位點，調節(jié)轉錄和DNA的修復和復制。PRDI-BF的升高也與激活態(tài)雪旺細胞的特殊的功能密切相關的。結論 5個

7、轉錄因子蛋白上調都與激活態(tài)雪旺細胞的快速分裂、高分泌狀態(tài)密切相關。 第三部分 應用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測激活態(tài)雪旺細胞信號轉導通路 目的 應用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測激活態(tài)雪旺細胞信號轉導通路。方法 采用熒火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶組成雙熒光素酶報告基因實驗系統(tǒng)，構建含NGF-TF與promotor/TRE的啟動子的載體，感染激活態(tài)雪旺細胞，雪旺細胞的處理則分為7組：1．激活態(tài)雪旺細胞空白對照：2．激活態(tài)雪

8、旺細胞+0.8μg pGL3+40 ng phRL-SV40；3．激活態(tài)雪旺細胞+0.8μg pGL3-NGFpromotor+40 ng phRL-SV40：4．激活態(tài)雪旺細胞+0.8 μg pGL3-NGFpromotor+40 ngphRL-SV40+加藥0.5小時；5．激活態(tài)雪旺細胞+0.8μg pGL3-NGFpromotor+40 ng phRL-SV40+加藥1小時：6．激活態(tài)雪旺細胞+0.8μg pGL3-NGFprom

9、otor+40 ng phRL-SV40+加藥1.5小時：7．激活態(tài)雪旺細胞+0.8μg pGL3-NGFpromotot+40 ng phRL-SV40+加藥2小時。結果 從第三組加入活化的NGF的啟動子但沒有加入抑制劑后，RLU1的數值含有激活態(tài)雪旺細胞自身的熒光、海腎熒光素酶的熒光強度和螢火蟲熒光素酶作用于底物的熒光強度的總和，因而數值最大，其相對值RLU1/RLU2也是最大，使用信號轉導抑制劑D609后，第四組在用藥0.5小時后