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文檔簡介
1、研究目的:
1、探討膠質(zhì)瘤細胞中是MKK7還是MKK4調(diào)控JNK-c-Jun活性;
2、探討HDAC在膠質(zhì)瘤細胞中是否調(diào)控MKK7或MKK4的表達;
3、探討是哪個或者哪些HDAC成員調(diào)控MKK7或MKK4的表達;
4、探討HDAC調(diào)控MKK7或MKK4的具體機制是什么;
5、探討干預HDAC或JNK-c-Jun活性是否影響膠質(zhì)瘤遷移、侵襲;
6、探討人腦膠質(zhì)瘤組織中HDAC與
2、MKK7或MKK4表達是否存在相關(guān)性。
研究方法:
1.在膠質(zhì)瘤細胞中使用小分子干擾沉默MKK7或MKK4,Western blot檢測p-JNK/JNK,以及p-c-Jun/c-Jun的表達。
2.用組蛋白去乙?;敢种苿?Histone deacetylases inhibitor HDACI):TSA、SAHA、M344、VPA處理多種膠質(zhì)瘤細胞后檢測MKK7,p-JNK/JNK,以及p-c-Jun/
3、c-Jun的表達。RT-PCR檢測MKK7 mRNA表達。
3.用小分子干擾HDAC、特異性HDACI、過表達HDAC等方法處理膠質(zhì)瘤細胞,檢測MKK7及p-JNK/JNK,p-c-Jun/c-Jun的表達及MKK7mRNA的表達。報道基因技術(shù)檢測MKK7熒光素表達。
4.(a)免疫細胞化學、細胞漿與核分離實驗檢測HDAC在細胞核與細胞漿的分布情況;
?。╞)染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immuno
4、precipitation,CHIP)檢測HDAC是否在 MKK7啟動子上;
?。╟)利用報道基因技術(shù)檢測截短或突變MKK7啟動子后對其活性的影響并尋找調(diào)控MKK7表達的轉(zhuǎn)錄因子;
?。╠)小分子干擾、過表達該轉(zhuǎn)錄因子,檢測對MKK7表達的影響,抑制HDAC情況下沉默該轉(zhuǎn)錄因子,檢測 MKK7蛋白及 mRNA表達。
(e)用抑制蛋白合成的抑制劑亞胺環(huán)己酮(cycloheximide,CHX)及抑制蛋白降解的抑制
5、劑MG132(Proteasome抑制劑)等處理,檢測其對MKK7蛋白的影響。
5、小分子干擾、過表達MKK7、HDAC以及特異性HDACI處理膠質(zhì)瘤細胞,Transwell實驗檢測這些處理對膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲能力的影響。
6、免疫組化檢測HDAC及MKK7在人腦膠質(zhì)瘤樣本中的表達及其相關(guān)性。
研究結(jié)果:
1.在膠質(zhì)瘤細胞中是MKK7而不是MKK4調(diào)控JNK-c-Jun活性
在膠質(zhì)瘤U
6、251、U87細胞中沉默MKK7或MKK4,Western blot顯示沉默MKK7后JNK-c-Jun活性下調(diào)。而沉默MKK4后JNK-c-Jun活性無明顯變化。
2.抑制HDAC抑制MKK7的表達從而抑制JNK-c-Jun活性
分別用HDACI:TSA、SAHA、M344、VPA處理U251、U87、T98G三種膠質(zhì)瘤細胞,均抑制MKK7,p-JNK,以及p-c-Jun表達均下調(diào),但JNK、c-Jun的表達未發(fā)生
7、改變。PCR顯示MKK7 mRNA表達下調(diào)。
3.HDAC4轉(zhuǎn)錄調(diào)控MKK7
在膠質(zhì)瘤U251中沉默HDAC,Western blot顯示在沉默HDAC4或HDAC6時MKK7均下調(diào),RT-PCR顯示沉默HDAC4后MKK7mRNA下調(diào),進一步使用HDAC4特異性HDACI:LMK235、Tasquinimod處理U251、U87、T98G后,Western blot顯示MKK7及p-JNK,p-c-Jun下調(diào),JN
8、K,c-Jun無明顯變化,RT-PCR顯示MKK7mRNA下調(diào),過表達HDAC4,MKK7及p-JNK,p-c-Jun上調(diào),JNK,c-Jun無明顯變化。RT-PCR提示MKK7mRNA上調(diào)。
4、轉(zhuǎn)錄因子SP1介導了在HDAC4滅活情況下MKK7的負調(diào)控
?。╝)將MKK7啟動子全長逐步截短,當截短到-149bp時MKK7的熒光素表達明顯升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義,而截短至-258bp時熒光素表達并沒有改
9、變,突變這一段中SP1結(jié)合位點,MKK7熒光素表達亦明顯升高(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。
(b)干預HDAC4的情況下檢測MKK7熒光素表達,結(jié)果與MKK7蛋白、mRNA改變是一致的。
?。╟)免疫熒光、細胞漿與細胞核分離實驗證明HDAC4在膠質(zhì)瘤細胞核中有表達,
(d)CHIP實驗證明HDAC4在MKK7的啟動子上。
?。╡)在U251、U87細胞中沉默SP1,Western blot顯示M
10、KK7上調(diào),而過表達SP1,MKK7下調(diào)。在使用HDAC4抑制劑LMK235抑制HDAC4情況下沉默SP1,MKK7蛋白和mRNA均上調(diào)。
5、HDAC6介導了MKK7的穩(wěn)定性
在U251、U87細胞中沉默HDAC6,Western blot顯示MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表達下調(diào),JNK、c-Jun表達沒有變化。但MKK7 mRNA卻無明顯變化。HDAC6特異性抑制劑Tubacin、CAY10603、AC
11、Y1215處理U251、U87、T98G細胞,MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表達下調(diào),JNK、c-Jun表達沒有變化。而RT-PCR顯示MKK7 mRNA無明顯變化。過表達HDAC6后MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表達上調(diào),但MKK7mRNA表達亦無明顯改變。CHX時間點處理U251、U87細胞,MKK7在2h就減少了一半,隨著時間延長MKK7減少的越來越多。抑制HDAC6情況下MG132處理U251細胞,MKK7的減少
12、受到抑制。
6、沉默MKK7抑制膠質(zhì)細胞遷移、侵襲,抑制HDAC4/HDAC6,抑制膠質(zhì)細胞遷移、侵襲
轉(zhuǎn)染siMKK7、siHDAC4、siHDAC6,用HDAC4抑制劑LMK235、Tasquinimod,HDAC6特異性抑制劑Tubacin、CAY10603處理U251細胞,Transwell實驗顯示
膠質(zhì)瘤細胞的遷移、侵襲能力明顯下降,而過表達MKK7、HDAC4、HDAC6,膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲能力
13、明顯增強。
7、人腦高級別膠質(zhì)瘤樣本中HDAC4/HDAC6與MKK7表達呈正相關(guān)
收集20例高級別膠質(zhì)瘤樣本,免疫組化檢測HDAC4/HDAC6與MKK7的表達,Pearson相關(guān)分析HDAC4與MKK7,HDAC6與MKK7的相關(guān)性。人腦高級別膠質(zhì)瘤樣本中HDAC4/HDAC6與MKK7表達呈正相關(guān)。
結(jié)論:
1、在膠質(zhì)瘤細胞中是MKK7而不是MKK4調(diào)控JNK-c-Jun活性;
2
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