去乙酰化組蛋白酶1在馬兜鈴酸腎病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、馬兜鈴酸腎?。ˋristolochic Acid Nephropathy，AAN)指長(zhǎng)期或過(guò)量使用含有馬兜鈴酸（Aristolochic Acid，AA）成分的中草藥導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)病變。馬兜鈴酸Ⅰ（aristolochc acidⅠ，AAⅠ）是AA中含量最高、毒性最強(qiáng)的成分，可引起上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞壞死或凋亡，觸發(fā)腎間質(zhì)纖維化。在纖維化過(guò)程中，上皮、內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT/EnMT）為肌成纖維細(xì)胞，被認(rèn)為

2、是在腎臟纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用的重要因素之一。EMT的信號(hào)由各種生長(zhǎng)因子/細(xì)胞因子集調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β）被認(rèn)為是EMT產(chǎn)生肌成纖維細(xì)胞最有力的生長(zhǎng)因素之一。通常認(rèn)為與其相關(guān)的受體、Smads蛋白、輔助因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的靶基因共同組成了一個(gè)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路。Smads蛋白有三種亞型：受體激活Smads蛋白（R-Smad）；共同介質(zhì)型Smads蛋白（Co-Smad

3、4）；抑制型Smads蛋白（I-Smad6、7）。其中I-Smads在蛋白降解方面以及對(duì) TGF-β信號(hào)的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。乙?；腟mad7可定向結(jié)合去乙酰化組蛋白酶1（histone deacetylases1，HDAC1）使其去乙?；M(jìn)行泛素化作用促進(jìn)蛋白的降解，當(dāng)HDAC1過(guò)度表達(dá)并被轉(zhuǎn)錄因子募集時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致與其相關(guān)的特定基因被非正常性抑制，從而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。因此，闡明Smad7的去乙酰化作用在TGF-β/ Sma

4、d7信號(hào)通路中對(duì)AAN的調(diào)控，了解分析HDAC1在AAN發(fā)病過(guò)程中的基因和蛋白表達(dá)以及蛋白定位，對(duì)于進(jìn)一步揭示馬兜鈴酸腎病具有重要的意義。
　　為此，本研究復(fù)制了小鼠AAN模型和小鼠原代RTECs細(xì)胞AAN模型，觀察了AAⅠ所致小鼠AAN的病理學(xué)特征，研究了AAⅠ作用下小鼠RTECs腎纖維化中相關(guān)因子及 TGF-β1/Smads信號(hào)通路分子相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平變化，分析了引起細(xì)胞纖維化的分子機(jī)制，探討了在 AAⅠ作用下小鼠腎間質(zhì)

5、纖維化的發(fā)病機(jī)理。其主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　AAⅠ對(duì)AAN和TGF-β1/Smads信號(hào)通路中相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)的影響
　　通過(guò)復(fù)制小鼠馬兜鈴酸腎纖維化（AAN）模型，檢測(cè)腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、Smad7和去乙酰化蛋白酶1（HDAC1）的mRNA和蛋白，分析AAN模型TGF-β1信號(hào)通路中HADC1和Smad7蛋白的分布與表達(dá)變化。免疫組織化學(xué)檢測(cè)CK-18、α-SMA的蛋白表達(dá)，定位HADC1和

6、Smad7蛋白；HE染色觀察腎臟的病理學(xué)變化；RT-PCR檢測(cè)TGF-β1、Smad7和HDAC1的mRNA表達(dá)；ELASA檢測(cè)TGF-β1的蛋白表達(dá)；Western Blot和免疫共沉淀檢測(cè)HADC1和Smad7蛋白表達(dá)及相互作用。結(jié)果表明，免疫組化結(jié)果顯示染毒組小鼠CK-18表達(dá)陰性，CK-18表達(dá)依次減弱趨勢(shì)；α-SMA表達(dá)陽(yáng)性，并隨給藥劑量逐漸增強(qiáng)。腎臟病理表現(xiàn)為腎小管濁腫、變性和脫落等急性小管間質(zhì)損傷并隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)

7、逐漸加重的趨勢(shì)。AAN模型腎組織中 TGF-β1和HDAC1 mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性升高，TGF-β1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組具有顯著性差異（P<0.05），TGF-β1蛋白從28 d開(kāi)始顯著升高，且與對(duì)照組比較差異極顯著（P<0.01）；Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，且自35 d開(kāi)始較對(duì)照組有顯著性的下降（P<0.05）；HDAC1mRNA和蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，28 d開(kāi)始AAN組中HDAC1mRNA水平極顯

8、著高于對(duì)照組（P<0.01）；HDAC1蛋白免疫組化染色強(qiáng)度呈上調(diào)趨勢(shì)，且HDAC1陽(yáng)性著色主要分布于上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核；免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在AAN中HDAC1與Smad7形成蛋白復(fù)合物。結(jié)論為成功復(fù)制了小鼠AAN模型，證實(shí)AAⅠ對(duì)小鼠腎臟具有明顯的損害作用，表現(xiàn)為早期腎間質(zhì)纖維化，證實(shí)了腎小管上皮細(xì)胞是AAⅠ作用的主要靶細(xì)胞。AAⅠ對(duì)AAN的發(fā)展具有時(shí)間和劑量依賴型作用，TGF-β1/Smad7信號(hào)參與了 AAⅠ誘導(dǎo)的E

9、MT，Smad7是 AAⅠ作用的靶點(diǎn)之一。HDACl蛋白高表達(dá)并與Smad7蛋白形成蛋白復(fù)合物，參與了TGF-β/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的AAN形成過(guò)程。
　　AAⅠ對(duì)小鼠原代RTECs中TGF-β1/Smads信號(hào)通路中相關(guān)因子的影響
　　通過(guò)構(gòu)建小鼠原代 RTECs的AAN模型，探討 AAⅠ對(duì) RTECs的作用及TGF-β1/Smads信號(hào)中相關(guān)因子的變化，闡明AAN的發(fā)病機(jī)制。培養(yǎng)小鼠原代RTECs細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀

10、察和免疫熒光染色鑒定細(xì)胞；RealTime-PCR檢測(cè)TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad7和HDAC1的mRNA表達(dá)；ELISA分析細(xì)胞上清中TGF-β1的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，膠原酶消化法成功培養(yǎng)小鼠原代RTECs。高濃度的AAⅠ短時(shí)間內(nèi)造成直接的腎小管上皮細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞脫落和壞死；小劑量的AAⅠ長(zhǎng)時(shí)間作用可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；100 ng/ml的AAⅠ隨作用于細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槔w維細(xì)胞樣。免疫熒光染色結(jié)果顯示，AAⅠ作用

11、細(xì)胞后，CK-18表達(dá)下調(diào)。AAⅠ可促進(jìn)TGF-β1、TβR-Ⅰ和HDAC1的mRNA表達(dá)，刺激細(xì)胞分泌TGF-β1，Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降。結(jié)論為成功培養(yǎng)了小鼠原代RTECs細(xì)胞，AAⅠ誘導(dǎo)RTECs細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，構(gòu)建小鼠原代RTECs細(xì)胞AAN模型，從體外試驗(yàn)證實(shí)了腎小管上皮細(xì)胞是AAⅠ作用的主要靶細(xì)胞，HDAC1是AAⅠ作用的靶點(diǎn)之一。AAⅠ可誘導(dǎo)小鼠原代RTECs細(xì)胞合成和分泌TGF-β1，抑制Smad7的表達(dá)，

12、證實(shí)了TGF-β1/Smads信號(hào)通路參與了AAⅠ誘導(dǎo)的間質(zhì)纖維化。
　　siRNA對(duì)小鼠原代RTECs中HDAC1基因的作用
　　通過(guò)建立有效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染小干擾 RNA（siRNA），抑制小鼠腎小管上皮細(xì)胞（Renal Tubular Epithelial Cells，RTECs）中去乙?；M蛋白酶1（Histone deacetylases1，HDAC1）的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路中其他因子的

13、蛋白表達(dá)，進(jìn)一步了解 AAN發(fā)展的分子機(jī)制。利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，熒光標(biāo)記siRNA（FAM-siRNA）篩選轉(zhuǎn)染比例，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time-PCR）確定最優(yōu)條件并檢測(cè)不同位點(diǎn)（374，525和822）HDAC1-siRNA的抑制效果，噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn) HDAC1-siRNA對(duì) RTECs增殖的影響，與曲古霉素A（TSA）對(duì)RTECs的作用效果相比較。Real-time PCR檢測(cè)對(duì)HDAC1 m

14、RNA表達(dá)的抑制作用，DNA階梯檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Western Blot檢測(cè)TβR-Ⅰ、Smad7和HADC1的蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果表明，熒光表達(dá)和Real-Time PCR結(jié)果顯示30 pmol siRNA:1.5μL LipofectamineTM2000為最佳轉(zhuǎn)染條件。Real-Time PCR結(jié)果表明HDAC1-374的干擾效果最明顯。HDAC1-374 MTT檢測(cè)結(jié)果與TSA的MTT結(jié)果一致，均能有效抑制RTECs的增殖。HDACl

15、-siRNA和TSA在體外均能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HDACl-siRNA轉(zhuǎn)染能有效地抑制細(xì)胞中HDAC1基因mRNA及蛋白的表達(dá)，Smad7蛋白表達(dá)增加，對(duì)TβR-Ⅰ的蛋白表達(dá)影響不大。結(jié)論為本試驗(yàn)利用脂質(zhì)體法成功轉(zhuǎn)染HDAC1-siRNA，抑制RTECs增殖，誘導(dǎo)RTECs凋亡，同TSA作用相似。HDAC1-siRNA抑制HDAC1的表達(dá)，解除AAN中Smad7的過(guò)度去乙酰化，增加Smad7蛋白表達(dá)，對(duì)于抗纖維化有重要意