小劑量一氧化氮在小鼠卵母細(xì)胞成熟中的作用及分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：觀察不同濃度一氧化氮(nitric oxide，NO)供體硝普鈉(sodium　nitroprusside,SNP)與一氧化氮合酶(NOS)抑制劑左旋硝基精氨酸甲基酯(N<'w>-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)對(duì)小鼠生發(fā)泡(germinal　vesicle，GV)期卵母細(xì)胞體外成熟的影響；在適宜濃度的NO、或/和L-NAME、或／和二丁酰環(huán)腺苷酸(dibutiry1 cyclicAMP，

2、dbcAMP)、或/和孕酮(progestone，P)共同作用下，觀察卵母細(xì)胞體外成熟的情況并分析它們之間的相互關(guān)系；在NO、L-NAME、dbcAMP、P等不同處理因素作用下，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中c-erbB<,2>mRNA表達(dá)的變化。利用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)卵母細(xì)胞中成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor，MPF)的調(diào)節(jié)亞基細(xì)胞周期蛋白B<,1>(cyclinB

3、<,1>)的合成變化、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated．proteinkinase,MAPK)的活性變化。為進(jìn)一步了解的卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟機(jī)理及其調(diào)控增添新資料，為開辟新的促生育和抗生育途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：給予3-4周齡健康雌性未成年昆明小白鼠腹腔注射PMSG 8IU。44-48小時(shí)后斷頭處死，取雙側(cè)卵巢，在體視顯微鏡下用已消毒的4號(hào)針頭小心剔除卵巢周圍脂肪和結(jié)締組織，刺破卵泡，釋放出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合

4、體(cumulus cell-enclosedoocyte,CEO)。用口徑大于復(fù)合卵直徑的口吸管吸取形態(tài)完好的GV期CEO，反復(fù)漂洗3次，移入每孔裝有950μl培養(yǎng)液，并加入不同處理因素的4孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔40-50個(gè)左右卵母細(xì)胞。在37℃、5％CO<,2>、95％空氣、100％濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h。觀察不同處理因素下，不同時(shí)間GVBD發(fā)生率和PBl排出率從而判斷卵母細(xì)胞的成熟情況。 結(jié)果：(1)小劑量一氧化氮供體SNP對(duì)

5、卵母細(xì)胞的成熟無(wú)作用。10<'-4>mol／L、10<'-5>mol／L、10<'-6>mol／L的SNP組與對(duì)照組比較，6h卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(germinal vesiclebreakdown．GVBD)率與12h第一極體排出(First polar body,PB1)率均無(wú)顯著性差別(P>0.05)(2)L-NAME抑制卵母細(xì)胞體外成熟，觀察發(fā)現(xiàn)10<'-2>mol／L、10<'-3>mo1／L L-NAME與對(duì)照組比較，卵母細(xì)胞

6、生發(fā)泡破裂(GVBD)率與第一極體(PBl)排出率均有所降低(P<0.05)。(3)d小劑量SNP(10<'-5>mol／L)能夠逆轉(zhuǎn)dbcAMP對(duì)卵母細(xì)胞的抑制作用，L-NAME減弱SNP對(duì)dbcAMP的逆轉(zhuǎn)作用。SNP+dbcAMP組與dbcAMP組相比較，卵母細(xì)胞GVBD率與PBl率均有所升高(P<0.05)。SNP+dbcAMP+L-NAME組與SNP+dbcAMP組比較，卵母細(xì)胞GVBD率與PBl率均有所降低(P<0.05)。

7、(4)P能夠逆轉(zhuǎn)dbcAMP對(duì)卵母細(xì)胞的抑制作用，P與SNP共同作用于卵母細(xì)胞時(shí)，對(duì)dbcAMP抑制起協(xié)同逆轉(zhuǎn)作用，L-NAME減弱SNP與P對(duì)dbcAMP的逆轉(zhuǎn)作用。P+dbcAMP組與dbcAMP組相比較，卵母細(xì)胞GVBD率與PB 1率均有所升高(P<0.05 )。 P+dbcAMP+SNP組與P+dbcAMP組相比較， 卵母細(xì)胞GVBD率與PBl率均有所升高(P<0.05)。P+dbcAMP+SNP+L-NAME組與P+dbcA

8、MP+SNP組比較，卵母細(xì)胞GVBD率與PBl率均有所降低，且有顯著性差別(P<0.05)。(5)RT-PCR結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中存在有C-erbB<,2>mRNA的表達(dá)，dbcAMP可以下調(diào)C-erbB<,2>mRNA的表達(dá)從而抑制卵母細(xì)胞的成熟，P與SNP則能逆轉(zhuǎn)dbc AMP對(duì)C-erbB2mRNA表達(dá)的下調(diào)作用，L-NAME減弱這種逆轉(zhuǎn)作用。(5)Western-blotting結(jié)果顯示：卵母細(xì)胞GVBD時(shí)，MAPK、M

9、PF被激活，dbcAMP抑制MAPK的磷酸化和cyclinBl的合成從而抑制卵母細(xì)胞的成熟，P與SNP能明顯逆轉(zhuǎn)dbc AMP對(duì)MAPK的磷酸化、cyclinB<,1>合成的抑制作用，使卵母細(xì)胞中的磷酸化的MAPK，cyclinB<,l>含量明顯增加，從而促進(jìn)MAPK、MPF的活化與細(xì)胞的成熟。L-NAME減弱P與SNP這種逆轉(zhuǎn)作用，L-NAME能明顯抑制MAPK的磷酸化和cyclinBl的合成使卵母細(xì)胞中的磷酸化的MAPK，cycli