二烯丙基三硫亞慢性毒性評(píng)價(jià)及其拮抗環(huán)磷酰胺毒性效果研究.pdf

1、研究目的
　　世界衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，癌癥是全球慢性非傳染性疾病中僅次于心血管疾病的第二大殺手。在我國(guó)，近十年來(lái)癌癥發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人體身心健康。目前，化學(xué)治療(Chemotherapy)是癌癥治療的主要手段。環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是作為一種臨床化療藥物，在癌癥治療中取得明顯效果，但在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)往往損害正常細(xì)胞，產(chǎn)生不同程度的毒副反應(yīng)，如降低白細(xì)胞水平、免疫抑制、骨髓抑

2、制、消化道癥狀以及精神萎靡、疲乏無(wú)力、脫發(fā)、過(guò)敏等其他表現(xiàn)。在我國(guó)，臨床上使用化療藥物治療腫瘤的同時(shí)，往往會(huì)聯(lián)合使用中藥提取物或中藥制劑以減輕化療所致的毒副反應(yīng)，并取得了一定效果。但中藥使用依然存在許多問(wèn)題，其繁多的藥物種類限制了有效藥物的篩選。
　　大蒜(Garlic)作為一種藥食兩用的植物，具有多種生物活性成分和營(yíng)養(yǎng)成分，廣泛地應(yīng)用于疾病預(yù)防和治療以及醫(yī)療保健中。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜具有抗菌消炎、降血脂、降血壓、減少血小板積聚、預(yù)防

3、心血管疾病以及抗腫瘤等作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)大蒜所表現(xiàn)出的這些藥用價(jià)值主要與其所含或能夠代謝產(chǎn)生的多種含硫化合物息息相關(guān)。
　　二烯丙基三硫(Diallyl Trisulfide，DATS)是從大蒜提取出的主要含硫化合物，是大蒜的主要活性成分。流行病調(diào)查及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DATS在人體、動(dòng)物、細(xì)胞水平上對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌等多種癌癥均有預(yù)防治療作用，其作用機(jī)制主要包括抑制殺傷腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;抑制腫瘤細(xì)胞

4、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn);細(xì)胞周期阻滯的調(diào)節(jié);抗氧化等，而DATS拮抗環(huán)磷酰胺化療引起的毒副作用及其本身的毒性罕見報(bào)道。
　　因此，本研究首先采用90天經(jīng)口染毒途徑，觀察了DATS對(duì)Wistar大鼠亞慢性毒性反應(yīng)，進(jìn)行DATS毒性安全評(píng)價(jià);進(jìn)而建立H22肝癌荷瘤小鼠動(dòng)物模型，以CTX作為化療藥物模型，選擇DATS進(jìn)行抗腫瘤干預(yù)，同時(shí)觀察DATS的抗腫瘤效果及其對(duì)化療毒副反應(yīng)的減毒增敏作用，以期為DATS亞慢性毒性安全評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為DATS

5、作為保健食品開發(fā)以及抗腫瘤的輔助性藥品開發(fā)提供依據(jù)。
　　研究方法
　　1 DATS90天經(jīng)口染毒亞慢性毒性評(píng)價(jià)
　　80只Wistar大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組、30 mg/kg.bw、60 mg/kg.bw、90 mg/kg.bw DATS劑量組，每組20只。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，將DATS溶于玉米油稀釋，經(jīng)口灌胃給予相應(yīng)劑量的DATS，灌胃體積為0.5ml/100g.bw，對(duì)照組經(jīng)口灌胃給予等體積的玉米油，每

6、天1次，連續(xù)90天。
　　動(dòng)物一般觀察、體重和食物利用率:實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狀態(tài)及異常表現(xiàn)，包括一般表現(xiàn)、行為、中毒及死亡情況。期間每周稱一次體重，并加食兩次，嚴(yán)格記錄動(dòng)物飼料攝入量和飼料剩余量，并計(jì)算食物利用率。
　　血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定:90天經(jīng)口染毒結(jié)束，各組動(dòng)物禁食16小時(shí)后斷頭取抗凝血，測(cè)定紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、白細(xì)胞(WBC)和白細(xì)胞分類（淋巴細(xì)胞、中性細(xì)胞、單核細(xì)胞）等

7、指標(biāo)。
　　血清生化指標(biāo)測(cè)定:90天經(jīng)口染毒結(jié)束，各組動(dòng)物禁食16小時(shí)后斷頭取血5ml于離心管中，室溫靜置1小時(shí)，3500 r/min離心10 min，分離血清，測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶活力(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力(ALT)、尿素氮含量(BUN)、肌酐含量(CREA)、總蛋白含量(TP)、白蛋白含量(ALB)、球蛋白含量(GLB)、總膽固醇含量(CHOL)、甘油三酯含量(TG)和葡萄糖含量(GLU)等指標(biāo)。
　　臟器系數(shù)測(cè)定:動(dòng)物處

8、死后，取肝、腎、脾、胃、卵巢或睪丸稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。
　　臟器病理形態(tài)學(xué)檢測(cè):每組隨機(jī)選取5只動(dòng)物，取其肝、脾、腎、胃、卵巢或睪丸部分組織置于多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色，檢測(cè)不同劑量組動(dòng)物臟器病理改變。
　　2 DATS抗腫瘤效果及其CTX化療所致毒副反應(yīng)的減毒增敏效果評(píng)價(jià)
　　荷瘤小鼠模型建立及分組:選用H22肝癌細(xì)胞株，接種6-8天左右的種鼠，抽取約5ml腹水于15ml無(wú)菌離心管中，腹水呈乳白色，

9、加入無(wú)菌生理鹽水充分混勻后離心5min，轉(zhuǎn)速為1000r/min，離心結(jié)束棄上清，洗兩次。加入無(wú)菌生理鹽水制備H22細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將其配制成濃度為2×107 cells/ml，充分混勻，備用。選用昆明小鼠，用75％酒精消毒接種部位皮膚，每只小鼠皮下接種H22細(xì)胞懸液0.2ml于左腋窩下，60min結(jié)束全部操作。24小時(shí)后將動(dòng)物編號(hào)，隨機(jī)分組。50只雄性昆明荷瘤小鼠隨機(jī)分為模型組、25mg/kg.bw CTX組、5

10、0mg/kg.bw DATS組、CTX+25mg/kg.bw DATS組和CTX+50mg/kg.bw DATS組，每組10只，第二天開始給藥。CTX用生理鹽水配制，腹腔注射，DATS溶于玉米油，經(jīng)灌胃給予，灌胃體積為0.2ml/10g.bw，對(duì)照組和CTX組給予等體積玉米油，每天1次，連續(xù)14天。
　　血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè):于實(shí)驗(yàn)第15天，摘眼球取抗凝血，進(jìn)行紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)。
　　瘤重及抑瘤率計(jì)算:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘眼球取

11、血處死小鼠，剝?nèi)⊥暾鰤K稱重，計(jì)算各組抑瘤率。
　　臟器系數(shù)測(cè)定:取小鼠肝臟、脾臟和胸腺，稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。
　　骨髓DNA含量測(cè)定:取小鼠一側(cè)完整股骨，去除軟組織，用10ml注射器抽取10ml0.005mol/L CaCl2將骨髓全部沖入離心管中，放置于4℃冰箱中靜置30min，2500r/min離心15min，棄上清。向沉淀物中加入0.2mol/L HClO45ml充分混勻，90℃加熱15min，冷卻后3500 r/m

12、in離心10min，取上清，紫光分光光度計(jì)268nm下測(cè)定其OD值。
　　研究結(jié)果
　　1 DATS90天經(jīng)口染毒亞慢性毒性評(píng)價(jià)
　　1.1 DATS對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀態(tài)和體重的影響
　　實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物活動(dòng)正常，無(wú)異常行為和中毒癥狀，無(wú)死亡。與對(duì)照組相比，從第8周開始，雌、雄90mg/kg.bw DATS劑量組體重增長(zhǎng)緩慢，而且雄性90mg/kg.bw DATS劑量組體重增加量與對(duì)照組相比有顯著性差異(p＜0.

13、05)。
　　1.2 DATS對(duì)大鼠飼料攝入量和食物利用率的影響
　　飼料攝入量結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，雄性90mg/kg.bw DATS劑量組從第5周開始飼料攝入量顯著減少(p＜0.05)，且該劑量組總飼料攝入量顯著性降低(p＜0.05)。
　　1.3 DATS對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響
　　與對(duì)照組相比，雄性30、60、90 mg/kg.bw DATS劑量組白細(xì)胞數(shù)顯著性升高(p＜0.05)，雌性30、90mg/

14、kg.bw DATS劑量組白細(xì)胞數(shù)顯著性提高(p＜0.05)。雄性90 mg/kg.bw DATS劑量組血小板顯著性升高(p＜0.05)。
　　1.4 DATS對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響
　　與對(duì)照組相比，雄性90 mg/kg.bw DATS劑量組尿素氮顯著性升高(p＜0.01)。雌性60、90mg/kg.bw DATS劑量組葡萄糖顯著低于對(duì)照組(p＜0.05，p＜0.01)，其中，90mg/kg.bw DATS劑量組總蛋白、

15、球蛋白、總膽固醇升高(p＜0.05，p＜0.01)。
　　1.5 DATS對(duì)大鼠臟器重量和臟/體系數(shù)的影響
　　與對(duì)照組相比，臟器重量指標(biāo)顯示，雄性60mg/kg.bw DATS劑量組肝臟重量增加(p＜0.05)，雄性60、90mg/kg.bw DATS劑量組脾臟重量顯著性增加(p＜0.05，p＜0.01)。與對(duì)照組相比，臟/體系數(shù)指標(biāo)顯示，雌、雄90mg/kg.bw DATS劑量組肝臟系數(shù)顯著性升高(p＜0.05，p＜0.

16、01)，雄性60、90mg/kg.bw DATS劑量組脾臟系數(shù)顯著性升高(p＜0.05)，雌性30、60、90mg/kg.bw DATS劑量組腎臟系數(shù)均顯著性升高(p＜0.01，p＜0.05)。
　　1.6 DATS對(duì)大鼠臟器病理形態(tài)的影響
　　與對(duì)照組相比，雌、雄30、60、90mg/kg.bw DATS劑量組肝臟、胃腸道、睪丸或卵巢均無(wú)明顯病理改變。雌、雄60、90mg/kg.bw DATS劑量組脾臟脾竇擴(kuò)張，紅髓淋巴細(xì)

17、胞增生，血細(xì)胞增多，含鐵血黃素顆粒沉著。雌、雄60mg/kg.bwDATS劑量組腎臟有輕微局灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管變性，90mg/kg.bw DATS劑量組呈現(xiàn)管型，腎臟細(xì)胞變性壞死，局灶性腎小管間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　2 DATS抗腫瘤效果及其對(duì)CP化療所致毒副反應(yīng)的減毒增敏效果評(píng)價(jià)
　　2.1 DATS對(duì)CTX化療小鼠體重的影響
　　與模型組相比，從第9天開始，25mg/kg.bw CTX組小鼠體重呈下降趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)

18、束時(shí)，體重下降明顯(p＜0.05)，25、50 mg/kgDATS干預(yù)組體重有所減輕，但與CTX組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。
　　2.2 DATS對(duì)CTX化療荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響
　　與模型組相比，25mg/kg.bw CTX組能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其抑瘤率達(dá)69.8％(p＜0.01)。25mg/kg DATS+CTX組、50mg/kg DATS+CTX組抑瘤率分別達(dá)67.9％(p＜0.01)和69.8％(p＜

19、0.01)，但與CTX組相比無(wú)明顯差異(p＞0.05)。與模型組相比，50mg/kg DATS組抑瘤率達(dá)32.0％(p＜0.05)，但與CTX組相比，其抑瘤效果存在明顯差異(p＜0.05)。
　　2.3 DATS對(duì)CTX化療荷瘤小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響
　　與模型組相比，25mg/kg.bw CTX組小鼠白細(xì)胞水平顯著下調(diào)(p＜0.05)，25mg/kg DATS+CTX組、50mg/kg DATS+CTX組白細(xì)胞水平有所升高，

20、但與CTX組相比，白細(xì)胞水平升高不明顯(p＞0.05)。CTX化療對(duì)小鼠紅細(xì)胞、血小板水平均無(wú)明顯影響(p＞0.05)。
　　2.4 DATS對(duì)CTXX化療荷瘤小鼠臟器重量及臟器系數(shù)的影響
　　與模型組相比，CTX化療對(duì)小鼠肝臟、腎臟重量及其系數(shù)影響較小(p＞0.05)但CTX化療能顯著降低小鼠脾臟、胸腺重量及其臟器系數(shù)(p＜0.05)。與CTX組相比，25mg/kg DATS+CTX組、50mg/kg DATS+CTX組能

21、顯著升高化療小鼠脾臟絕對(duì)重量和脾臟系數(shù)(p＜0.05)，但對(duì)胸腺重量及胸腺系數(shù)影響不明顯(p＞0.05)。
　　2.5 DATS對(duì)CTX化療荷瘤小鼠骨髓DNA含量的影響
　　與模型相比，25mg/kg.bw CTX化療能顯著降低骨髓DNA含量(p＜0.05)，DATS干預(yù)對(duì)骨髓DNA含量有多提升，但與CTX組相比，其升高水平不明顯(p＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1.90天亞慢性毒性試驗(yàn)表明，DATS可以有效升高