二烯丙基三硫亞慢性毒性評價及其拮抗環(huán)磷酰胺毒性效果研究.pdf

1、研究目的
　　世界衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果顯示，癌癥是全球慢性非傳染性疾病中僅次于心血管疾病的第二大殺手。在我國，近十年來癌癥發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重危害人體身心健康。目前，化學治療(Chemotherapy)是癌癥治療的主要手段。環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是作為一種臨床化療藥物，在癌癥治療中取得明顯效果，但在殺傷癌細胞的同時往往損害正常細胞，產(chǎn)生不同程度的毒副反應，如降低白細胞水平、免疫抑制、骨髓抑

2、制、消化道癥狀以及精神萎靡、疲乏無力、脫發(fā)、過敏等其他表現(xiàn)。在我國，臨床上使用化療藥物治療腫瘤的同時，往往會聯(lián)合使用中藥提取物或中藥制劑以減輕化療所致的毒副反應，并取得了一定效果。但中藥使用依然存在許多問題，其繁多的藥物種類限制了有效藥物的篩選。
　　大蒜(Garlic)作為一種藥食兩用的植物，具有多種生物活性成分和營養(yǎng)成分，廣泛地應用于疾病預防和治療以及醫(yī)療保健中。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜具有抗菌消炎、降血脂、降血壓、減少血小板積聚、預防

3、心血管疾病以及抗腫瘤等作用。同時，研究發(fā)現(xiàn)大蒜所表現(xiàn)出的這些藥用價值主要與其所含或能夠代謝產(chǎn)生的多種含硫化合物息息相關。
　　二烯丙基三硫(Diallyl Trisulfide，DATS)是從大蒜提取出的主要含硫化合物，是大蒜的主要活性成分。流行病調查及實驗研究發(fā)現(xiàn)，DATS在人體、動物、細胞水平上對胃癌、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌等多種癌癥均有預防治療作用，其作用機制主要包括抑制殺傷腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞凋亡;抑制腫瘤細胞

4、轉移和浸潤;細胞周期阻滯的調節(jié);抗氧化等，而DATS拮抗環(huán)磷酰胺化療引起的毒副作用及其本身的毒性罕見報道。
　　因此，本研究首先采用90天經(jīng)口染毒途徑，觀察了DATS對Wistar大鼠亞慢性毒性反應，進行DATS毒性安全評價;進而建立H22肝癌荷瘤小鼠動物模型，以CTX作為化療藥物模型，選擇DATS進行抗腫瘤干預，同時觀察DATS的抗腫瘤效果及其對化療毒副反應的減毒增敏作用，以期為DATS亞慢性毒性安全評價提供實驗依據(jù)，為DATS

5、作為保健食品開發(fā)以及抗腫瘤的輔助性藥品開發(fā)提供依據(jù)。
　　研究方法
　　1 DATS90天經(jīng)口染毒亞慢性毒性評價
　　80只Wistar大鼠，雌雄各半，隨機分為對照組、30 mg/kg.bw、60 mg/kg.bw、90 mg/kg.bw DATS劑量組，每組20只。動物適應性喂養(yǎng)5天后，將DATS溶于玉米油稀釋，經(jīng)口灌胃給予相應劑量的DATS，灌胃體積為0.5ml/100g.bw，對照組經(jīng)口灌胃給予等體積的玉米油，每

6、天1次，連續(xù)90天。
　　動物一般觀察、體重和食物利用率:實驗期間，每天觀察并記錄實驗動物狀態(tài)及異常表現(xiàn)，包括一般表現(xiàn)、行為、中毒及死亡情況。期間每周稱一次體重，并加食兩次，嚴格記錄動物飼料攝入量和飼料剩余量，并計算食物利用率。
　　血液學指標測定:90天經(jīng)口染毒結束，各組動物禁食16小時后斷頭取抗凝血，測定紅細胞（RBC）、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、白細胞(WBC)和白細胞分類（淋巴細胞、中性細胞、單核細胞）等

7、指標。
　　血清生化指標測定:90天經(jīng)口染毒結束，各組動物禁食16小時后斷頭取血5ml于離心管中，室溫靜置1小時，3500 r/min離心10 min，分離血清，測定谷草轉氨酶活力(AST)、谷丙轉氨酶活力(ALT)、尿素氮含量(BUN)、肌酐含量(CREA)、總蛋白含量(TP)、白蛋白含量(ALB)、球蛋白含量(GLB)、總膽固醇含量(CHOL)、甘油三酯含量(TG)和葡萄糖含量(GLU)等指標。
　　臟器系數(shù)測定:動物處

8、死后，取肝、腎、脾、胃、卵巢或睪丸稱重并計算臟器系數(shù)。
　　臟器病理形態(tài)學檢測:每組隨機選取5只動物，取其肝、脾、腎、胃、卵巢或睪丸部分組織置于多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，進行HE染色，檢測不同劑量組動物臟器病理改變。
　　2 DATS抗腫瘤效果及其CTX化療所致毒副反應的減毒增敏效果評價
　　荷瘤小鼠模型建立及分組:選用H22肝癌細胞株，接種6-8天左右的種鼠，抽取約5ml腹水于15ml無菌離心管中，腹水呈乳白色，

9、加入無菌生理鹽水充分混勻后離心5min，轉速為1000r/min，離心結束棄上清，洗兩次。加入無菌生理鹽水制備H22細胞懸液，用臺盼藍染色，進行細胞計數(shù)，將其配制成濃度為2×107 cells/ml，充分混勻，備用。選用昆明小鼠，用75％酒精消毒接種部位皮膚，每只小鼠皮下接種H22細胞懸液0.2ml于左腋窩下，60min結束全部操作。24小時后將動物編號，隨機分組。50只雄性昆明荷瘤小鼠隨機分為模型組、25mg/kg.bw CTX組、5

10、0mg/kg.bw DATS組、CTX+25mg/kg.bw DATS組和CTX+50mg/kg.bw DATS組，每組10只，第二天開始給藥。CTX用生理鹽水配制，腹腔注射，DATS溶于玉米油，經(jīng)灌胃給予，灌胃體積為0.2ml/10g.bw，對照組和CTX組給予等體積玉米油，每天1次，連續(xù)14天。
　　血液學指標檢測:于實驗第15天，摘眼球取抗凝血，進行紅細胞、白細胞和血小板計數(shù)。
　　瘤重及抑瘤率計算:實驗結束后摘眼球取

11、血處死小鼠，剝取完整瘤塊稱重，計算各組抑瘤率。
　　臟器系數(shù)測定:取小鼠肝臟、脾臟和胸腺，稱重，計算臟器系數(shù)。
　　骨髓DNA含量測定:取小鼠一側完整股骨，去除軟組織，用10ml注射器抽取10ml0.005mol/L CaCl2將骨髓全部沖入離心管中，放置于4℃冰箱中靜置30min，2500r/min離心15min，棄上清。向沉淀物中加入0.2mol/L HClO45ml充分混勻，90℃加熱15min，冷卻后3500 r/m

12、in離心10min，取上清，紫光分光光度計268nm下測定其OD值。
　　研究結果
　　1 DATS90天經(jīng)口染毒亞慢性毒性評價
　　1.1 DATS對實驗動物一般狀態(tài)和體重的影響
　　實驗期間，各組動物活動正常，無異常行為和中毒癥狀，無死亡。與對照組相比，從第8周開始，雌、雄90mg/kg.bw DATS劑量組體重增長緩慢，而且雄性90mg/kg.bw DATS劑量組體重增加量與對照組相比有顯著性差異(p＜0.

13、05)。
　　1.2 DATS對大鼠飼料攝入量和食物利用率的影響
　　飼料攝入量結果顯示，與對照組相比，雄性90mg/kg.bw DATS劑量組從第5周開始飼料攝入量顯著減少(p＜0.05)，且該劑量組總飼料攝入量顯著性降低(p＜0.05)。
　　1.3 DATS對大鼠血液學指標的影響
　　與對照組相比，雄性30、60、90 mg/kg.bw DATS劑量組白細胞數(shù)顯著性升高(p＜0.05)，雌性30、90mg/

14、kg.bw DATS劑量組白細胞數(shù)顯著性提高(p＜0.05)。雄性90 mg/kg.bw DATS劑量組血小板顯著性升高(p＜0.05)。
　　1.4 DATS對大鼠血清生化指標的影響
　　與對照組相比，雄性90 mg/kg.bw DATS劑量組尿素氮顯著性升高(p＜0.01)。雌性60、90mg/kg.bw DATS劑量組葡萄糖顯著低于對照組(p＜0.05，p＜0.01)，其中，90mg/kg.bw DATS劑量組總蛋白、

15、球蛋白、總膽固醇升高(p＜0.05，p＜0.01)。
　　1.5 DATS對大鼠臟器重量和臟/體系數(shù)的影響
　　與對照組相比，臟器重量指標顯示，雄性60mg/kg.bw DATS劑量組肝臟重量增加(p＜0.05)，雄性60、90mg/kg.bw DATS劑量組脾臟重量顯著性增加(p＜0.05，p＜0.01)。與對照組相比，臟/體系數(shù)指標顯示，雌、雄90mg/kg.bw DATS劑量組肝臟系數(shù)顯著性升高(p＜0.05，p＜0.

16、01)，雄性60、90mg/kg.bw DATS劑量組脾臟系數(shù)顯著性升高(p＜0.05)，雌性30、60、90mg/kg.bw DATS劑量組腎臟系數(shù)均顯著性升高(p＜0.01，p＜0.05)。
　　1.6 DATS對大鼠臟器病理形態(tài)的影響
　　與對照組相比，雌、雄30、60、90mg/kg.bw DATS劑量組肝臟、胃腸道、睪丸或卵巢均無明顯病理改變。雌、雄60、90mg/kg.bw DATS劑量組脾臟脾竇擴張，紅髓淋巴細

17、胞增生，血細胞增多，含鐵血黃素顆粒沉著。雌、雄60mg/kg.bwDATS劑量組腎臟有輕微局灶性炎細胞浸潤，腎小管變性，90mg/kg.bw DATS劑量組呈現(xiàn)管型，腎臟細胞變性壞死，局灶性腎小管間質炎細胞浸潤。
　　2 DATS抗腫瘤效果及其對CP化療所致毒副反應的減毒增敏效果評價
　　2.1 DATS對CTX化療小鼠體重的影響
　　與模型組相比，從第9天開始，25mg/kg.bw CTX組小鼠體重呈下降趨勢，實驗結

18、束時，體重下降明顯(p＜0.05)，25、50 mg/kgDATS干預組體重有所減輕，但與CTX組相比無統(tǒng)計學差異（p＞0.05）。
　　2.2 DATS對CTX化療荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率的影響
　　與模型組相比，25mg/kg.bw CTX組能顯著抑制腫瘤的生長，其抑瘤率達69.8％(p＜0.01)。25mg/kg DATS+CTX組、50mg/kg DATS+CTX組抑瘤率分別達67.9％(p＜0.01)和69.8％(p＜

19、0.01)，但與CTX組相比無明顯差異(p＞0.05)。與模型組相比，50mg/kg DATS組抑瘤率達32.0％(p＜0.05)，但與CTX組相比，其抑瘤效果存在明顯差異(p＜0.05)。
　　2.3 DATS對CTX化療荷瘤小鼠血液學指標的影響
　　與模型組相比，25mg/kg.bw CTX組小鼠白細胞水平顯著下調(p＜0.05)，25mg/kg DATS+CTX組、50mg/kg DATS+CTX組白細胞水平有所升高，

20、但與CTX組相比，白細胞水平升高不明顯(p＞0.05)。CTX化療對小鼠紅細胞、血小板水平均無明顯影響(p＞0.05)。
　　2.4 DATS對CTXX化療荷瘤小鼠臟器重量及臟器系數(shù)的影響
　　與模型組相比，CTX化療對小鼠肝臟、腎臟重量及其系數(shù)影響較小(p＞0.05)但CTX化療能顯著降低小鼠脾臟、胸腺重量及其臟器系數(shù)(p＜0.05)。與CTX組相比，25mg/kg DATS+CTX組、50mg/kg DATS+CTX組能

21、顯著升高化療小鼠脾臟絕對重量和脾臟系數(shù)(p＜0.05)，但對胸腺重量及胸腺系數(shù)影響不明顯(p＞0.05)。
　　2.5 DATS對CTX化療荷瘤小鼠骨髓DNA含量的影響
　　與模型相比，25mg/kg.bw CTX化療能顯著降低骨髓DNA含量(p＜0.05)，DATS干預對骨髓DNA含量有多提升，但與CTX組相比，其升高水平不明顯(p＞0.05)。
　　結論
　　1.90天亞慢性毒性試驗表明，DATS可以有效升高