二烯丙基三硫(DATS)拮抗苯誘導(dǎo)的白細(xì)胞減少及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　苯是廣泛存在于職業(yè)環(huán)境和生活環(huán)境中的污染物，1982年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)確定為環(huán)境致癌物質(zhì)。在我國，慢性苯中毒連續(xù)多年位于慢性職業(yè)中毒原因的首位。吸煙和汽車尾氣的排放是生活環(huán)境中苯的主要來源，苯污染已經(jīng)成為亟待解決的環(huán)境污染問題。苯具有血液毒性，誘發(fā)血細(xì)胞減少，再生障礙性貧血，粒細(xì)胞白血病等，早期以外周血白細(xì)胞減少癥為主要特征。苯的毒性作用尚無明確的閾值，流行病學(xué)的資料發(fā)現(xiàn)，即使空氣中的苯暴露濃度低于1pp

2、m，職業(yè)工人的外周血白細(xì)胞和血小板計數(shù)明顯低于對照組，因此，日常生活生活中預(yù)防苯中毒顯得尤為重要，開發(fā)有效的營養(yǎng)策略來防治環(huán)境中的苯中毒具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　大蒜在受到切割、擠壓等處理時，大蒜中的蒜氨酸酶被激活，催化蒜氨酸轉(zhuǎn)化為大蒜素，迅速被代謝分解生成多種有機(jī)硫化物(OSCs)，如二烯丙基一硫(DAS)，二烯丙基二硫(DADS)，二烯丙基三硫(DATS)、烯丙基甲基硫化物(AMS)、S-烯丙基半胱氨酸(SAC)和S-烯

3、丙基巰基半胱氨酸(SAMC)等。已知大蒜中的有機(jī)硫化物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗菌、化學(xué)預(yù)防作用等生物活性。尤其是大蒜有機(jī)硫化物能通過促進(jìn)化學(xué)毒物的解毒和排出，從而發(fā)揮化學(xué)預(yù)防作用。王碩等人的研究發(fā)現(xiàn)，二烯丙基三硫能通過調(diào)節(jié)代謝酶細(xì)胞色素P450酶，拮抗正己烷誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)損傷。曾濤等人的研究表明，在荷瘤小鼠中，大蒜油（大蒜脂溶性提取物）能抑制化療藥物環(huán)磷酰胺和放射治療誘導(dǎo)的外周血白細(xì)胞減少癥。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，大

4、蒜油能拮抗苯誘導(dǎo)的外周血白細(xì)胞減少癥，但其有效成分和作用機(jī)制尚不明確。有研究表明，大蒜有機(jī)硫化物的生物活性可能與硫集團(tuán)數(shù)目有關(guān)。
　　因此，本研究選用大蒜提取物中含有三個有機(jī)硫基團(tuán)的二烯丙基三硫(DATS)作為干預(yù)藥物，經(jīng)口灌胃建立苯誘導(dǎo)白細(xì)胞減少癥的動物模型，觀察二烯丙基三硫?qū)Ρ秸T導(dǎo)的外周血白細(xì)胞減少癥的拮抗作用，并從抗細(xì)胞凋亡、抗氧化、調(diào)節(jié)苯代謝、PI3K/Nrf2/ARE通路調(diào)節(jié)四個方面，分析其可能的作用機(jī)制。以期為開發(fā)二烯

5、丙基三硫的藥效作用提供理論依據(jù)，為慢性苯中毒的防治提供營養(yǎng)防治策略。
　　方法：
　　1.觀察大蒜的三種有機(jī)硫制劑對苯誘導(dǎo)的白細(xì)胞減少癥的預(yù)防作用。
　　昆明小鼠110只，隨機(jī)分為11組，即空白對照組、模型組、大蒜勻漿(GH)低、高劑量干預(yù)組、大蒜勻漿對照組、大蒜油(GO)低、高劑量干預(yù)組、大蒜油對照組、二烯丙基三硫(DATS)低、高劑量干預(yù)組和DATS對照組。除空白對照組和苯模型組外，分別用GH，GO和DATS經(jīng)口灌

6、胃進(jìn)行干預(yù)，2h后，苯模型組和各干預(yù)組經(jīng)口給與苯-玉米油混懸液(1.3g/kg BW)染毒，對照組給與同等體積的玉米油，每天一次，共21天。全自動血球計數(shù)儀檢測外周血中白細(xì)胞計數(shù)(WBC)，分離肝臟、脾臟和胸腺，計算臟器指數(shù)和肝臟、脾臟組織切片病理學(xué)檢查，觀察三種大蒜制劑對苯誘導(dǎo)的靶器官損傷的保護(hù)作用，并比較可能的不良事件。
　　2.PI3K-Akt通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和抗氧化作用在DATS拮抗苯誘導(dǎo)的外周血細(xì)胞減少癥中的作用

7、>　　60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別為:空白對照組，模型組，DATS低、中、高干預(yù)組和DATS對照組，每組10只。3個DATS干預(yù)組分別經(jīng)口給予DATS(15，30，45mg/kg BW)，2h后，除了2個對照組給與同體積玉米油外，其余4組大鼠均經(jīng)口灌胃苯-玉米油混懸液(1.3g/kg BW)建造苯誘導(dǎo)白細(xì)胞減少癥動物模型，每天1次。28天后，經(jīng)腹主動脈取血，檢測外周血細(xì)胞計數(shù)。分離外周血中的單個核細(xì)胞(PBMCs)和股骨中的骨髓

8、細(xì)胞(BMCs)，分別用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平，Weston blot檢測凋亡相關(guān)蛋白和PI3K-Akt通路蛋白的表達(dá)。測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平評估氧化應(yīng)激水平，檢測非酶性抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽(GSH)水平，抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性，評估抗氧化能力。
　　3.苯體內(nèi)代謝的調(diào)節(jié)在DATS拮抗苯誘導(dǎo)的外周血白細(xì)胞減少癥的中毒作用

9、r>　　50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，即空白對照組，模型組，DATS低、高干預(yù)組和DATS對照組，每組10只。DATS干預(yù)組和對照組大鼠分別經(jīng)口灌胃不同劑量DATS(15，30mg/kg.BW)，其他組給與同體積玉米油，2h后，除對照組外，經(jīng)口灌胃苯(1.3g/kg/d)建造苯誘導(dǎo)外周血白細(xì)胞減少癥模型，每天1次，共28天。收集24小時尿液，高效液相色譜分析尿中苯代謝物苯巰基尿酸(SPMA)和反式-反式粘糠酸(t，t-MA)的含量;腹

10、主動脈取血，全自動血球計數(shù)儀分析外周血細(xì)胞計數(shù)，化學(xué)法檢測肝臟代謝酶細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST和骨髓組織中代謝酶髓過氧化物酶酶(MPO)、NADPH:醌氧化還原酶(NQO1)的活性，Western Blot檢測這些代謝酶的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.觀察大蒜的三種有機(jī)硫制劑對苯誘導(dǎo)的白細(xì)胞減少癥的預(yù)防作用。
　　結(jié)果顯示，模型組小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)降低至對照組的41.31

11、％(p＜0.01)，而大蒜勻漿(400mg/kg)、大蒜油(60mg/kg)和DATS(30mg/kg)干預(yù)后，外周血白細(xì)胞計數(shù)分別比模型組增加了144.04，140.07和148.34，各干預(yù)對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肝臟指數(shù)在各組間無統(tǒng)計學(xué)差異，病理檢查未發(fā)現(xiàn)異常，而苯模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別比空白對照組降低44.99和54.04，脾結(jié)節(jié)減少，胸腺萎縮。而三種大蒜制劑干預(yù)后，脾臟和胸腺指數(shù)均明顯增高，僅大蒜

12、勻漿(400m g/kg)和大蒜油(60mg/kg)對照組，小鼠脾臟腫大，脾臟指數(shù)比空白對照組高32.03和28.61(p＜0.05)。苯染毒后，小鼠體重明顯下降，三種干預(yù)均能在一定程度上使體重恢復(fù)增長，但DATS效果最好。
　　2.PI3K-Akt通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和抗氧化作用在DATS拮抗苯誘導(dǎo)的外周血細(xì)胞減少癥中的作用
　　模型組大鼠外周血白細(xì)胞(WBC)和紅細(xì)胞(RBC)計數(shù)分別降低至對照組的31.0和79.2。而D

13、ATS(30，45mg/kg)能有效抑制外周血細(xì)胞的減少。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平的結(jié)果顯示，模型組大鼠外周血單核細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的凋亡率分別增至對照組的274和284。Weston blot的實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax和活化的caspase-3的蛋白表達(dá)上調(diào)，磷酸化PI3K和Akt蛋白表達(dá)下調(diào)。而DATS干預(yù)能有效抑制這些反應(yīng)，并呈劑量依賴趨勢。相對于模型組，在30，45mg/kg DATS干預(yù)組中，DA

14、TS干預(yù)使外周血WBC數(shù)量增加至267.1和304.8％，而RBC數(shù)量增加至108.6和117.7％。細(xì)胞凋亡水平下降，凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也相應(yīng)恢復(fù)，PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也恢復(fù)正常水平。苯染毒后，模型組中大鼠的PBMCs和BMCs氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，PMBCs中的ROS和MDA水平分別增高3.4和1.5倍，BMC中的ROS和MDA水平分別增高3.3和2.2倍。PBMCs和BMCs中的GSH水平分別降低42.7和45.

15、2，抗氧化酶SOD、GSH-Px和GR活性均下降。DATS干預(yù)后，細(xì)胞中氧化應(yīng)激參數(shù)下降，氧化酶活性增強(qiáng)，GSH含量增加，并呈一定的劑量依賴性。
　　3.苯體內(nèi)代謝的調(diào)節(jié)在DATS拮抗苯誘導(dǎo)的外周血白細(xì)胞減少癥的中毒作用
　　苯暴露后，大鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)比空白對照組降低了65.5，尿中可檢測到兩種苯代謝物。DATS干預(yù)后，大鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)比模型組分別增高0.64和1.67倍，尿中t，t-MA水平分別降低了19.84和5

16、3.68，而SPMA水平增加了0.55倍和0.92倍。苯暴露后，參與苯活化代謝的代謝酶CYP2E1和MPO的酶活性分別增高為對照組的1.80倍和3.03倍，而參與苯解毒代謝的GST和NQO1的酶活性分別減低為對照組的70.53和42.44，酶蛋白表達(dá)水平也表現(xiàn)為類似變化。DATS干預(yù)后這一現(xiàn)象可明顯逆轉(zhuǎn)，特別在DATS(30mg/kg)干預(yù)組中，CYP2E1和MPO的酶活性和蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組，而GSTT1和NQO1酶活性和蛋白

17、表達(dá)水平明顯高于對照組(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.生大蒜勻漿、大蒜油和DATS三種大蒜制劑均能有效拮抗苯誘導(dǎo)的外周血白細(xì)胞減少癥，其中DATS預(yù)防效果和安全性最好。
　　2.DATS能通過激活抗氧化酶和提高非酶性抗氧化物的水平，拮抗外周血單核細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中苯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。
　　3.苯誘導(dǎo)的外周血細(xì)胞減少可能與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞和骨髓細(xì)胞凋亡有關(guān)，DATS能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡有效拮抗苯誘導(dǎo)的