復(fù)方腸泰誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬活化巨噬細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)觀察復(fù)方腸泰誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞分泌的自噬體對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7活化的影響，探討復(fù)方腸泰誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬與抗腫瘤免疫之間的內(nèi)在關(guān)系，從腫瘤免疫學(xué)原理來(lái)闡明復(fù)方腸泰的抗腫瘤作用機(jī)制，為中藥在抗腫瘤免疫的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、復(fù)方腸泰誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞自噬的研究
　　利用MTT比色法觀察不同濃度復(fù)方腸泰對(duì)CT26.WT細(xì)胞增殖的影響，明確最

2、適給藥濃度;Western Blot檢測(cè)不同濃度復(fù)方腸泰作用于CT26.WT細(xì)胞后自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá);采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建eGFP-LC3 CT26.WT細(xì)胞株，復(fù)方腸泰干預(yù)后熒光顯微鏡下觀察自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)及分布。
　　2、復(fù)方腸泰誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞分泌的自噬體的提取與鑒定
　　顯微鏡觀察復(fù)方腸泰處理CT26.WT細(xì)胞48h后細(xì)胞形態(tài)的變化，利用專利技術(shù)提取囊泡類物質(zhì)，通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)胞的超微

3、結(jié)構(gòu)變化、電鏡及Westem Blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)以鑒定所提物質(zhì)是否為自噬體。
　　3、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)誘導(dǎo)分泌的自噬體的識(shí)別與攝取
　　以CFSE標(biāo)記所提取的自噬體，將其加入RAW264.7細(xì)胞（6μg/ml終濃度）培養(yǎng)48h，流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦觀察巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)自噬體的識(shí)別和攝取。
　　4、誘導(dǎo)分泌的自噬體活化小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的研究
　　將提取的自噬體

4、作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7（6μg/ml終濃度），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)自噬體對(duì)RAW264.7細(xì)胞膜表面共刺激分子CD80、CD40的表達(dá);ELISA檢測(cè)自噬體刺激巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌量;qPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞活化的相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-1β的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果:
　　1、MTT結(jié)果顯示低濃度復(fù)方腸泰作用結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞48h，細(xì)胞活性無(wú)顯著變化，

5、無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用，高濃度復(fù)方腸泰對(duì)CT26.WT細(xì)胞有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性。復(fù)方腸泰處理轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白(EGFP)融合了自噬標(biāo)記蛋白LC3的CT26.WT細(xì)胞后，陰性對(duì)照組中可見(jiàn)綠色熒光均勻分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)，而加入不同濃度的復(fù)方腸泰處理后可見(jiàn)胞漿內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光點(diǎn)，代表著自噬體的形成增多。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)隨著復(fù)方腸泰濃度的增加而表達(dá)量升高，陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素組亦出現(xiàn)同樣現(xiàn)象，表明

6、復(fù)方腸泰作用于CT26.WT細(xì)胞后可誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，并形成自噬體。
　　2、顯微鏡下觀察復(fù)方腸泰處理CT26.WT細(xì)胞48h后形態(tài)出現(xiàn)顯著變化，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量囊泡樣顆粒，隨著濃度的增加，囊泡逐漸增多增大。透射電鏡進(jìn)一步證實(shí)復(fù)方腸泰干預(yù)結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞后有大量具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡形成。利用專利技術(shù)提取細(xì)胞內(nèi)的囊泡樣物質(zhì)后，經(jīng)電鏡觀察其結(jié)構(gòu)、大小、Western Blot鑒定結(jié)果顯示所提取的囊泡類物質(zhì)中含有大量LC3Ⅱ，證實(shí)

7、其為腫瘤細(xì)胞分泌的自噬體。
　　3、以CFSE標(biāo)記所提取的自噬體刺激RAW264.7細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦觀察結(jié)果顯示自噬體能夠被巨噬細(xì)胞有效的識(shí)別并攝取。
　　4、將所提取的自噬體作用RAW264.7細(xì)胞48h之后，可顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞表面的共刺激分子CD80及CD40的表達(dá)，增加巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的TNF-α、IL-6細(xì)胞因子的分泌量，升高巨噬細(xì)胞活化的相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-1

8、β的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)論:
　　復(fù)方腸泰作用于結(jié)腸癌CT26.WT細(xì)胞后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，分泌的自噬體能夠被巨噬細(xì)胞有效識(shí)別并攝取，自噬體作用于巨噬細(xì)胞后可顯著上調(diào)其表面的共刺激分子CD80及CD40的表達(dá)，增加培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的分泌量，且提高巨噬細(xì)胞活化的相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-1β的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，表明復(fù)方腸泰誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的自噬體可激活巨噬細(xì)胞，