BMSCs抑制矽肺大鼠肺泡巨噬細(xì)胞自噬活化的體外研究.pdf

1、目的：通過(guò)體內(nèi)染塵制備大鼠矽肺模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探討：1.在大鼠矽肺的發(fā)生過(guò)程中AM內(nèi)是否存在自噬的激活；2. BMSCs移植對(duì)AM自噬的調(diào)控影響；3. BMSCs對(duì)AM自噬的調(diào)控與PI3K-AKT-mTOR-P70S6K信號(hào)通路的關(guān)系。
　　方法：1.動(dòng)物分組及模型制備：90只SPF級(jí)雄性SD大鼠（體質(zhì)量180~220g）隨機(jī)分為三組：模型對(duì)照組（control group）、矽肺模型組（model group）、BMSC

2、s治療組（BMSCs treatment group）；5只SPF級(jí)雄性SD大鼠（3～5周齡，體質(zhì)量100~120g）用于 BMSCs分離及培養(yǎng)。采用非暴露式一次性氣管灌注法制備大鼠矽肺模型，一次性灌注滅菌氯化鈉溶液與 SiO2粉塵混懸液（50mg/ml）1.0ml；模型對(duì)照組灌注滅菌氯化鈉溶液1.0ml；BMSCs治療組于造模24h后經(jīng)尾靜脈注入BMSCs混懸液1.0ml，約3×106個(gè)細(xì)胞。2.檢測(cè)指標(biāo)及方法：①BMSCs的鑒定：流

3、式細(xì)胞儀檢測(cè) BMSCs表面標(biāo)記物 CD29，CD45，CD54，CD106的表達(dá)；②一般形態(tài)學(xué)觀察：蘇木素-伊紅（HE）染色觀察AM形態(tài)；③免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè) LC-3，Beclin-1，mTOR，P70S6K的表達(dá)及分布；④免疫印跡法檢測(cè) LC-3，Beclin-1，mTOR，P70S6K的蛋白表達(dá)量；⑤透射電鏡觀察自噬體的形成。3.定量測(cè)定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性度強(qiáng)弱用Image-ProPlus6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖

4、像分析系統(tǒng)半定量分析測(cè)定，以積分光密度值（IOD值）來(lái)表示。蛋白定量用Image J醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)PVDF膜上蛋白特異表達(dá)條帶進(jìn)行半定量分析，得出平均光密度值（OD值），最后以目標(biāo) OD值比內(nèi)參（β-actin）OD值的比值作為分析對(duì)象進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)用 Excel建庫(kù)，均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（?x±s）表示，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，兩組間比較用qq檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、r>　　結(jié)果：1. BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：BMSCs原代細(xì)胞胞體小，基本為均勻梭形或圓形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細(xì)胞，細(xì)胞折光性強(qiáng)，以分散的克隆聚集方式增殖。10d后原代細(xì)胞95％融合，此時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳至第三代，形態(tài)更為均一，呈梭形成纖維細(xì)胞樣。2. BMSCs表面標(biāo)記物表達(dá)的鑒定結(jié)果：結(jié)果顯示細(xì)胞CD29、CD106抗體陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.04％、75.49％，為陽(yáng)性表達(dá)，CD45、CD54抗體陽(yáng)性表達(dá)率分別為4.0

6、7％、4.85％，為陰性表達(dá)。3. AM的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示模型對(duì)照組 AM圓形或橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰，輪廓清楚，形態(tài)均一，未見矽塵吞噬顆粒。與模型對(duì)照組相比，矽肺模型組 AM體積增大，圓形、橢圓形或不規(guī)則形，形態(tài)不均一，細(xì)胞輪廓不清，部分細(xì)胞可看到毛刺樣突起，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央或一側(cè)，胞質(zhì)更加疏松豐富，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見吞噬的矽塵顆粒。BMSCs治療組與矽肺模型組相比，AM受損程度有所減輕，細(xì)胞形態(tài)不均一。4.免疫細(xì)胞化學(xué)染

7、色結(jié)果：模型對(duì)照組 LC-3，Beclin-1僅有微弱表達(dá)，呈現(xiàn)淡棕黃色。與模型對(duì)照組相比，矽肺模型組在各時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)均增強(qiáng)（P<0.05），并且其表達(dá)變化呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性變化趨勢(shì)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，其表達(dá)至14d時(shí)達(dá)高峰（P<0.05），28d時(shí)有所降低，但仍高于模型對(duì)照組的表達(dá)（P<0.05）。與矽肺模型組相比，BMSCs治療組在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均減弱（P<0.05），但表達(dá)趨勢(shì)未變。模型對(duì)照組 mTOR，P70S6

8、K蛋白有一定量表達(dá)，呈現(xiàn)棕褐色。與模型對(duì)照組相比，矽肺模型組在各時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)均減弱（P<0.05），并且其表達(dá)變化呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性變化趨勢(shì)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)強(qiáng)度逐漸降低，其14d時(shí)表達(dá)至低峰（P<0.05），28d時(shí)有所回升，但仍低于模型對(duì)照組的表達(dá)（P<0.05）。與矽肺模型組相比，BMSCs治療組在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均增強(qiáng)（P<0.05），但表達(dá)趨勢(shì)未變。5. Western blot檢測(cè)結(jié)果：在模型對(duì)照組 LC-3，Beclin

9、-1蛋白僅有微量基礎(chǔ)表達(dá)，且各時(shí)間點(diǎn)間表達(dá)無(wú)明顯變化。矽肺模型組和BMSCs治療組LC-3，Beclin-1動(dòng)態(tài)表達(dá)與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果相吻合。在模型對(duì)照組 mTOR，P70S6K蛋白有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，且各時(shí)間點(diǎn)間表達(dá)無(wú)明顯變化。矽肺模型組和BMSCs治療組 mTOR，P70S6K動(dòng)態(tài)表達(dá)與免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果相吻合。6.透射電鏡結(jié)果：模型對(duì)照組 AM胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，完整，細(xì)胞基質(zhì)均勻一致，溶酶體豐富，線粒體結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰，核