青霉G蛋白信號通路對糖苷水解酶合成調(diào)控初探及其在構(gòu)建表達系統(tǒng)中的應用.pdf

1、植物為主的生物質(zhì)資源是自然界最大的再生資源庫，也被看作生物燃料以及生物煉制最大的原料庫，因此有效地降解這些以多糖（纖維素或淀粉）形式儲存的生物質(zhì)是實現(xiàn)可再生資源利用的關鍵。利用微生物產(chǎn)生的糖苷水解酶來降解自然界儲藏的淀粉或木質(zhì)纖維素是生物質(zhì)利用的有效途徑。青霉是自然界中廣泛存在的一種腐生絲狀真菌，草酸青霉（Penicillium.oxalicum，原名為斜臥青霉P.decumbens）114-2是本實驗室從土壤中分離得到的一株生長快速，

2、與里氏木霉相比，酶組分更加豐富，組成更加合理，其高產(chǎn)突變株也已經(jīng)用于工業(yè)纖維素酶生產(chǎn)多年。隨著其基因組測序以及相關組學分析的完成，其高產(chǎn)纖維素酶的機理得到一定的揭示。然而纖維素酶的表達調(diào)控是一個多水平且復雜的過程，而近年來關于纖維素酶轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控研究已經(jīng)相對較多，研究者們逐漸將目光轉(zhuǎn)向纖維素酶被誘導的前期過程，若能解析清楚纖維素信號轉(zhuǎn)導過程或者發(fā)現(xiàn)關鍵的信號轉(zhuǎn)換蛋白，將對認識纖維素酶的調(diào)控機制以及進一步進行高產(chǎn)菌株的改造具有重要的指導

3、意義。
　　除了通過理性的改造進一步提高菌株產(chǎn)酶量的同時，人們也在努力探索降解木質(zhì)纖維素等生物質(zhì)材料的最優(yōu)酶系配比以及高性能的單酶組分。絲狀真菌如草酸青霉、里氏木霉，雖然能分泌數(shù)量較多的糖苷水解酶，但仍然有相當數(shù)量的糖苷水解酶基因處于沉默狀態(tài)，這些未被表達或者表達量極低的基因中很可能就包含全新的或者性能更加優(yōu)良的單酶組分。而要獲得對這些未知蛋白的了解，首先必須將它們有效表達出來，但由于蛋白在合成過程中的折疊和糖基化的差異性，常用的

4、大腸桿菌以及酵母表達系統(tǒng)有時并不能將來源于絲狀真菌的蛋白有活性地表達出來，因此，構(gòu)建合適的表達系統(tǒng)將是方便且大規(guī)模挖掘新酶資源的重要前提。
　　本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.G蛋白信號信號轉(zhuǎn)導通路對在糖苷水解酶合成調(diào)控中的功能研究
　　首先通過生物信息學分析，我們在草酸青霉中找到了八個最有可能參與纖維素酶信號轉(zhuǎn)導途徑的蛋白，它們包含G蛋白偶聯(lián)膜受體以及胞內(nèi)激酶，對它們進行單基因敲除后并未發(fā)現(xiàn)這些基因的缺失對

5、菌株表型及胞外糖苷水解酶的表達產(chǎn)生明顯影響。
　　然后，我們研究了接受G蛋白偶聯(lián)膜受體信號的異三聚體G蛋白。發(fā)現(xiàn)G蛋白的α亞基PGA3在草酸青霉的淀粉酶和纖維素酶表達過程中起不同的調(diào)控作用。當草酸青霉缺失了PGA3后，胞外的淀粉酶幾乎不分泌，主要纖維素外切酶CBHI的分泌沒有受到明顯影響，而胞外β-葡萄糖苷酶BGL1的酶活力也顯著下降。而持續(xù)性激活PGA3后，淀粉酶活力顯著升高，CBHI酶活力和BGL1的酶活力略有下降。進一步對相

6、應糖苷水解酶的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，缺失株中淀粉酶活力的下降以及激活株中淀粉酶活力的上升主要是由淀粉酶基因amy15A的表達量下調(diào)和上調(diào)引起。另外，在缺失pga3后，外切酶酶活雖然無明顯變化，但其轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，而激活株以及突變株中β-葡萄糖苷酶bgl1的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢不明顯。而當在突變株△pga3培養(yǎng)過程中，胞外添加cAMP或者其類似物db-cAMP后，又能恢復淀粉酶的分泌，這說明淀粉酶的表達依賴于PGA3介導的胞內(nèi)cAMP水平。

7、通過對PGA3的缺失株以及激活株中與纖維素酶以及淀粉酶相關轉(zhuǎn)錄因子分析發(fā)現(xiàn)，這種對淀粉酶以及纖維素酶的不同的調(diào)控方式主要由cAMP所介導的轉(zhuǎn)錄因子AmyR表達水平不同而引起的。
　　2.草酸青霉低背景組成型蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建和應用研究
　　首先，通過敲除草酸青霉114-2中的最主要的淀粉酶Amy15A得到突變株△15A，發(fā)現(xiàn)突變株在以淀粉為唯一碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)時，胞外蛋白分泌量很少，這樣獲得了的低胞外蛋白表達背景。然后，我們

8、從草酸青霉中篩選了三個組成型強啟動子，為了檢驗表達系統(tǒng)的可行性，我們成功地用它們表達了三個原本表達量極低的木質(zhì)纖維素酶，它們分別為β-葡萄糖苷酶BGL4，木聚糖酶Xyn10B和內(nèi)切葡萄糖苷酶Cel12A，當以淀粉為唯一碳源進行培養(yǎng)時，釋放到胞外的主要蛋白酶條帶和酶活均為對應的目的蛋白、而當以麥麩纖維素為碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)時，胞外可分泌出包含目的蛋白在內(nèi)的纖維素酶重組酶系，其中過表達BGL4和Cel12A使得濾紙酶活FPA的比酶活上升，而過

9、表達Xyn10B使得FPA的酶活略有上升，但FPA的比酶活基本無變化。因此，草酸青霉組成型蛋白表達系統(tǒng)很適合篩選那些不表達或者低表達的木質(zhì)纖維素酶，通過改變培養(yǎng)基中的碳源，能夠方便地得到較純的酶液（淀粉上），或者方便地檢測到包含過表達了的目的蛋白在內(nèi)的纖維素重組酶系（纖維素上）。
　　3.運用G蛋白信號轉(zhuǎn)導通路提高低背景蛋白表達系統(tǒng)的表達量
　　為了進一步提高淀粉培養(yǎng)條件下的蛋白表達量，本研究通過重新對之前構(gòu)建的低背景表達系

10、統(tǒng)進行優(yōu)化。首先，由于檢測到淀粉培養(yǎng)條件下，淀粉能對淀粉酶起誘導作用，所以選擇了主要淀粉酶Amy15A的啟動子作為蛋白表達的啟動子并進一步進行改造。首先，從G蛋白的持續(xù)性激活株出發(fā)，利用基因工程手段在其中過表達淀粉酶的轉(zhuǎn)錄激活因子AmyR的同時將另一淀粉酶Amy13A敲除掉，通過轉(zhuǎn)錄水平的檢測發(fā)現(xiàn)，當用Amy13A的啟動子過表達AmyR時，AmyR的表達量最高，同時也使得Amy15A的表達量最高，胞外SDS-PAGE顯示淀粉酶Amy15

11、A的條帶明顯增強而淀粉酶Amy13A幾乎消失，通過蛋白含量測定發(fā)現(xiàn)，AmyR過表達株的胞外蛋白量(主要是Amy15A)是野生株114-2的3倍。然后，我們將過表達株中的Amy15A進行敲除從而獲得低蛋白背景的表達宿主A11△。另外，我們將淀粉酶Amy15A的啟動子以及trpC的終止子構(gòu)建成表達質(zhì)粒。為了驗證此表達系統(tǒng)，我們將來源于草酸青霉的纖維二糖水解酶CBHI以及里氏木霉的內(nèi)切葡萄糖苷酶EGI連接上表達質(zhì)粒并成功轉(zhuǎn)化宿主，結(jié)果顯示，這