草酸青霉β-半乳糖苷酶在畢赤酵母GS115中的表達(dá)及其應(yīng)用.pdf

1、β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase，EC3.2.1.23），俗稱乳糖酶，是在動(dòng)植物及微生物中廣泛存在的一種多功能酶，既具有水解乳糖的活性，又具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷的活性。以乳糖為底物，能斷開乳糖分子的葡萄糖基和半乳糖基間的β-(1，4)糖苷鍵，并將游離半乳糖苷殘基連接到乳糖或葡萄糖上，形成非消化性的低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，簡稱GOS）。目前，我國大規(guī)模生產(chǎn)中用到的β-半乳糖苷酶主要依賴于進(jìn)口，所

2、以研究和開發(fā)具有優(yōu)良特性的β-半乳糖苷酶具有良好的應(yīng)用前景。
　　從奶牛場附近土壤中篩選的草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）的β-半乳糖苷酶具有較高的水解和轉(zhuǎn)糖苷活性，但該酶是胞內(nèi)酶，不利于提取與利用。本研究將該胞內(nèi)酶在畢赤酵母GS115（Pichia pastorisGS115）中成功實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，并對(duì)重組菌的產(chǎn)酶發(fā)酵條件、酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用方面進(jìn)行了研究，為其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的參考。主

3、要研究結(jié)果如下：
　　（1）為獲得β-半乳糖苷酶編碼基因GalA，提取草酸青霉的RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了GalA基因序列，借助于pPICZαA表達(dá)載體，將GalA基因整合至 P.pastorisGS115中，以不同濃度Zeocin篩選，篩選獲得了高拷貝數(shù)的P.pastoris GS115/pPICZαA-GalA菌株。經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組β-半乳糖苷酶的表觀分子量為110kDa，酶活性為12.34U·mL

4、-1，表明成功構(gòu)建了P.pastoris GS115/pPICZαA-GalA菌株。
　?。?）單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了重組菌P.pastorisGS115/pPICZαA-GalA產(chǎn)β-半乳糖苷酶的搖瓶發(fā)酵條件，在接種量為8％、初始誘導(dǎo)pH值為6.0、培養(yǎng)溫度為29℃、甲醇添加量為1.5%和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為120h的條件下β-半乳糖苷酶的表達(dá)水平為33.16U·mL-1，酶活性是優(yōu)化前的2.69倍。通過對(duì)重組菌的粗酶液分離純化，該酶最終比

5、酶活為100.31 IU·mg-1，回收率為44.1%，純化倍數(shù)是粗酶液的2.3倍。研究了重組的β-半乳糖苷酶的性質(zhì)，其反應(yīng)最適溫度為60℃，在溫度55℃及以下，重組酶穩(wěn)定性較好；最適pH值為5.0，且在pH值為4.5～8.5，相對(duì)酶活維持80%以上。除Cu2+與SDS對(duì)酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用，其他的金屬離子和化合物對(duì)酶活性影響不明顯。該酶對(duì)鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）的Km和Vmax分別為1.32mmol·L-1和17

6、.54mmol·L-1·min-1；對(duì)乳糖的Km和Vmax分別為1.15mmol·L-1和13.38mmol·L-1·min-1。
　?。?）本研究將重組β-半乳糖苷酶與市售的大腸桿菌的β-半乳糖苷酶和米曲霉的β-半乳糖苷酶進(jìn)行比較，在水解8 h時(shí)，重組β-半乳糖苷酶水解乳糖率為90.3%，米曲霉的β-半乳糖苷酶水解效率為75.4%，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶水解效率為64.6%。以乳糖為底物，分別研究了初始乳糖濃度、酶的添加量和酶