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文檔簡介
1、本文通過PCR將HisTag與PGA融合,在具有T7啟動子的pET-24a(+)質粒載體中進行表達,建立了一個通用的PGA表達和純化方法,發(fā)酵獲得的粗酶經Co2+-IDA瓊脂載體一步純化。四種重組野生型PGA(AfPGA、EcPGA、KcPGA、PrPGA)一步純化收率分別為27.6%、36.3%、33.6%、19.7%;純化倍數分別為40、183、107、17。對得到的四種重組PGA測定其參與7-ADCA和D-苯甘酰胺合成頭孢氨芐反應
2、的S/H,分別為2.5、13、17、3.3?! 〔捎孟∮忻柑幚砦宸N青霉素G?;富?A.faecalis、B.megaterium、E.coli、K.citrophila、P.rettgeriPGAs)進行DNA家族混組得到嵌合體基因α亞基嵌合子庫。在KcPGA基因的1054位(在α亞基和連接肽后)進行沉默突變引入一KpnI位點,構建含有該突變基因的質粒(骨架載體),從而容納嵌合體基因α亞基。PCR獲得的嵌合體片斷和骨架載體經Nde
3、I/KpnI酶切后連接轉化,約5000個轉化子通過抑菌圈法(25mmol/L7-ADCA,50mmol/LD-PGA)初篩得到抑菌圈較大的嵌合體克隆,共篩得約400個克隆?! 『Y得的突變菌體經試管發(fā)酵,用HPLC分析,挑選合成與水解產物峰面積比對照(KcPGA)高2倍以上的克隆進行進一步實驗?! ”狙芯拷⒘艘环N通用的克隆、表達和純化各種PGA的方法,使平行比較各種PGA的性質以及通過定點突變和定向進化(亞基重組、DNA家族混組、基
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