HIV-1 Tat與DNA-PKcs相互作用及采用TALEN與CRISPR敲除細胞Tip60的研究.pdf

1、HIV-1 Tat蛋白是一個由HIV-1編碼的調控蛋白，對于HIV病毒的轉錄和復制具有至關重要的作用。Tat蛋白可以和宿主細胞內多種蛋白發(fā)生相互作用促進HIV病毒轉錄，并通過誘導淋巴細胞凋亡破壞宿主免疫系統(tǒng)。此外，Tat可以作為一個旁分泌分子由受感染細胞分泌進入未受感染細胞進而增加其感染風險。DNA-PKcs是DNA依賴的蛋白激酶復合物DNA-PK的主要催化亞基，屬于磷脂酰肌醇3-激酶超家族(PI3K)，在DNA損傷后非同源末端修復過程

2、中發(fā)揮重要作用。DNA損傷發(fā)生后，DNA-PKcs通過Ku蛋白轉移到DNA損傷末端，從而被DNA末端激活啟動DNA損傷修復反應。不僅如此， DNA-PKcs在V(D)J重組、細胞周期調控、凋亡與自吞噬過程中均發(fā)揮重要作用。
　　在此之前實驗室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Tat能夠抑制DNA-PKcs的表達，增強細胞對電離輻射的敏感度，并且能夠通過與Plk-1、Cyclin B、Tip60相互作用影響細胞周期變化。此外還證實HIV-1 Tat能夠直接結

3、合DNA-PKcs的核心啟動子序列參與其表達下調，并首次將DNA-PKcs核心啟動子區(qū)域由先前報道的-106～-3縮短至-63～-1。并發(fā)現(xiàn)HIV-1 Tat可以直接激活DNA-PKcs激酶活性，其活性水平與Tat蛋白成劑量依賴關系。在此基礎上，進行了進一步研究，取得的主要科研進展有:
　　1.通過免疫共沉淀與GST-pull down實驗，進一步證實了HIV-1 Tat可以直接與DNA-PKcs發(fā)生相互作用，同時無論內源還是外源

4、Tat蛋白，都能夠明顯增強DNA-PKcs的S2056位點磷酸化水平。
　　2.既然DNA-PKcs作為類別轉換重組(CSR)的重要組成部分，為探索這一機制對Tat蛋白在CSR過程中的作用進行了檢測，結果顯示低濃度（4μg/ml）的Tat蛋白能夠有效抑制類別轉換重組的發(fā)生，而高濃度（8μg/ml）時則會刺激CSR的發(fā)生。
　　3.既然Tat可以與DNA-PKcs相互作用并調控其活性，那么DNA-PKcs是否也可以通過Tat參

5、與調控HIV-1轉錄水平，結果顯示低水平且具有活性的DNA-PKcs對于HIV-1的轉錄是必不可少的，而DNA-PKcs在高表達水平且激酶活性較低時則能夠明顯抑制HIV-1的轉錄。
　　4.免疫共沉淀實驗表明DNA-PKcs雖能夠與cyclin T1、CDK9、Tat形成一個巨大的復合體，但DNA-PKcs僅僅與CDK9和Tat蛋白直接結合而與cyclin T1并無直接相互作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)對于未來DNA-PKcs的研究提

6、供了一個新的方向，對Tat蛋白在宿主體液免疫中作用的研究提供了新的思路與理論意義。同時提出了一種的可能性，即是否可以通過對DNA-PKcs的直接抑制和干預抑制艾滋病患者體內HIV-1的轉錄，這對未來抗HIV治療及其新藥的研制提供了新的策略。
　　Tip60(Tat interactive protein，60kD)最早是通過酵母雙雜交的方法所鑒定出來的可以與HIV1-tat相互作用的蛋白，由于其分子量為60kd，故被命名為Tip6

7、0。Tip60屬于MYST乙酰基轉移酶家族，主要參與乙酰化組蛋白H2A、H3、H4及多種相關蛋白，調控相關基因轉錄及下游分子應答。大量文獻已經(jīng)報道Tip60可以作為轉錄調控因子與核受體及轉錄因子結合進一步激活或者抑制下游基因的表達，如雄激素受體、AICD/Fe65、NCoR、c-MYC、E2F等，此外Tip60還可以通過乙?；幌盗械鞍渍{控其活性與穩(wěn)定性。當DNA雙鏈發(fā)生斷裂損傷后，Tip60可以通過乙酰化ATM的K3016位點促進AT

8、M發(fā)生自磷酸化進而激活下游底物P53、chk2，誘導DNA損傷修復反應。綜上所述，可以看到Tip60在基因轉錄、DNA損傷修復、細胞信號轉導、細胞周期檢查點、凋亡與自吞噬等方面均發(fā)揮重要調控作用。此外，Tip60還可以影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，它的失活將會導致DNA損傷修復缺陷及癌癥風險的增加。
　　由于Tip60基因雙位點敲除小鼠會導致胚胎致死，分別采用了當前最先進的TALEN與CRISPR兩種基因敲除技術在細胞水平穩(wěn)定敲除內源性T

9、ip60基因，建立能夠穩(wěn)定敲除Tip60基因的細胞系，為后續(xù)研究Tip60在DNA損傷修復、細胞周期調控、自吞噬調控中的作用打下基礎。
　　TALEN技術實驗流程:
　　首先根據(jù)Tip60基因序列并結合生物信息學設計多個靶位點識別序列;分別根據(jù)識別序列進行TALEN質粒對的構建工作;成功構建并測序驗證后提取質粒;直接采用提取的TALEN質粒對轉染HEK293細胞，并于轉染48h后提取多克隆細胞基因組;采用對應引物PCR擴增含

10、有切割位點的基因序列，并于回收后進行退火處理，最后采用T7核酸內切酶酶切檢測靶位點是否發(fā)生變化進而對TALEN切割效率進行檢測。
　　接下來選擇具有較高切割效率的TALEN質粒對轉染細胞;并于48h后將細胞稀釋至96孔板培養(yǎng)，使每孔理論上只有一個細胞;當培養(yǎng)約4～5周左右待細胞長滿后傳至12孔板繼續(xù)擴增培養(yǎng);待其再次長滿后取部分細胞提取單克隆細胞基因組;采用PCR技術擴增靶片段，并將單克隆細胞基因組PCR回收產(chǎn)物與野生型細胞基因組

11、PCR回收產(chǎn)物混合后退火處理;采用T7內切酶酶切鑒定篩選陽性單克隆;選擇陽性片段克隆到T載體，測序篩選移碼突變細胞系，篩選Tip60基因穩(wěn)定敲除的細胞系。
　　CRISPR技術實驗流程:
　　CRISPR技術同樣根據(jù)Tip60基因序列并結合生物信息學設計多個靶位點識別序列并根據(jù)設計的靶位點進行CRISPR識別序列的構建;待識別序列構建好并測序驗證成功后通過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝為慢病毒;將包裝好的CRISPR慢病毒感染U2OS細

12、胞，感染48h后使用嘌呤霉素對細胞進行處理，將篩選過的細胞再次感染Cas9腺病毒后提取細胞基因組;采用對應引物PCR擴增含有切割位點的基因序列并退火處理，最后采用T7核酸內切酶酶切檢測CRISPR切割效率與活性。
　　選擇具有較高切割效率的CRISPR慢病毒感染細胞48小時并用puro處理一周后感染腺病毒;將存活細胞稀釋至96孔板中進行培養(yǎng)，使每孔理論上只有一個細胞;之后篩選工作與TALEN技術相同，采用T7內切酶酶切鑒定篩選出穩(wěn)