HIV-1病毒Tat蛋白影響細胞輻射敏感性及作用機制研究.pdf

1、HIV感染導致人類免疫缺陷綜合癥(AIDS)有可能引起更多腫瘤的發(fā)生，研究表明卡波氏肉瘤(KS)和非何杰金淋巴瘤的發(fā)病率在艾滋病人要比普通人群高出20倍。腺癌、何杰金氏淋巴瘤和平滑肌肉瘤在兒童發(fā)病的風險較普通人群高出5—20倍。對于HIV感染的腫瘤病人，手術(shù)治療有高風險性，放射治療是主要的治療方式。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，艾滋病合并腫瘤患者放療后產(chǎn)生的正常組織和皮膚毒性反應明顯高于普通腫瘤患者。實驗室研究也進一步支持臨床觀察，AIDS合并非

2、何杰金淋巴瘤的病人對輻射反應敏感，來源于HIV感染的卡波氏肉瘤病人皮膚活組織的成纖維細胞，對輻射較非HIV感染的細胞敏感。人類免疫缺陷病病毒(HIV)表達的Tat蛋白是HIV感染早期所合成的小分子調(diào)節(jié)蛋白，能促進HIV基因表達，增加HIV病毒的復制和感染性。此外，在HIV感染過程中，Tat蛋白能分泌到細胞外，作用于未受HIV感染的CD4+細胞和單核．巨噬細胞，使其更易受HIV的感染。因此Tat作為一個胞外蛋白和細胞基因表達的激活因子在A

3、IDS發(fā)生及相關(guān)病變過程中起重要作用。目前研究顯示，Tat蛋白與機體交互作用會影響細胞輻射敏感性，但對于AIDS合并腫瘤的病人輻射敏感性發(fā)生改變的機制仍不清楚。 本研究使用轉(zhuǎn)染HIV-1tat基因的人橫紋肌肉瘤細胞系模型，探討Tat蛋白對細胞輻射敏感性的影響以及相關(guān)機制，獲得如下主要結(jié)果： (1)使用重疊PCR技術(shù)，從我國河南省駐馬店地區(qū)的一名HIV-1感染者外周血標本中擴增出完整的tat基因序列。將該基因編碼產(chǎn)物與其它

4、HIV-1病毒株Tat蛋白進行多序列對比分析發(fā)現(xiàn)：第一外顯子編碼產(chǎn)物的三個保守區(qū)域的氨基酸組成大致是相同的，只有少數(shù)氨基酸存在差異，tat基因的克隆為研究其功能并以其為靶點設(shè)計和篩選抗艾滋病的藥物奠定基礎(chǔ)。 (2)成功構(gòu)建了表達Tat蛋白的穩(wěn)定細胞模型，使用報告質(zhì)粒KB／SPlLTR檢測發(fā)現(xiàn)，90％以上的TE671．tat細胞具有Tat蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能，為進一步研究Tat蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。 (3)利用兩個表達Tat

5、蛋白的細胞系TT2和TE671-Tat進行對比研究發(fā)現(xiàn)：Tat蛋白能促進細胞增殖，表達Tat蛋白的細胞其增殖速度加快；細胞活存分析證明，表達Tat蛋白的細胞對電離輻射敏感性明顯增加；單細胞中性電泳以及7-H2AX位點的檢測證明，Tat蛋白能夠降低細胞對輻射誘發(fā)DNA雙鏈斷裂修復能力。另外，在接受電離輻射后，表達Tat蛋白的細胞凋亡增加。 (4)細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，TE671細胞和TT2細胞經(jīng)4GyY射線照射后表現(xiàn)出程度不同的G2／

6、M期阻滯，有意思的是表達Tat的TT2細胞G2／M阻滯出現(xiàn)較TE671細胞晚，而在照射后48h時TE671細胞G2／M期阻滯己恢復，但TT2細胞阻滯仍很顯著。另外，TT2細胞S期阻滯時間延長。表明Tat蛋白能導致細胞周期G2／M期檢查點功能紊亂，致使電離輻射作用后的細胞周期反應異常。 (5)在基因芯片的檢測中發(fā)現(xiàn)，與DNA損傷修復及細胞周期調(diào)控相關(guān)的5個基因Cdc25C、KIF2C、Cdc20、DNA-PKcs和CTSl在轉(zhuǎn)染t

7、砒基因的細胞中表達下調(diào)；首次發(fā)現(xiàn)，HIV-1Tat蛋白增加細胞對電離輻射的敏感性，至少有部分原因是通過抑制DNA-PKcs表達降低DNA雙鏈斷裂的修復能力實現(xiàn)。 (6)首次發(fā)現(xiàn)，細胞周期蛋白cyclinBl的表達在轉(zhuǎn)染tat基因細胞中明顯增強，但對cyclinB1mRNA水平無明顯影響。放線菌酮阻斷及免疫共沉淀實驗表明：cyclinBl表達水平的增強是蛋白穩(wěn)定性改變的結(jié)果。另外，實驗進一步揭示：表達Tat蛋白細胞中Cdkl酪氨酸