HIV-1與CD4+T細(xì)胞F-actin相互作用的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像研究.pdf

1、CD4+T細(xì)胞是HIVW-1病毒侵染的重要宿主細(xì)胞，其肌動(dòng)蛋白F-actin在HIV-1侵染過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。然而，對(duì)于F-actin在HIV-1侵染過(guò)程中作用的理解，主要來(lái)自于體外生化實(shí)驗(yàn)、電子顯微鏡成像以及免疫組化等研究結(jié)果。迄今，還未能實(shí)現(xiàn)HIV-1病毒侵染CD4+T細(xì)胞過(guò)程中與F-actin相互作用的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像。本研究基于對(duì)HIV-1病毒的熒光標(biāo)記和CD4+T細(xì)胞F-actin的熒光標(biāo)記，利用激光共聚焦熒光顯微鏡和超分辨SI

2、M成像分析技術(shù)，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、超分辨可視化研究HIV-1與CD4+T細(xì)胞F-actin的相互作用。
　　首先，在包含HIV-1全基因組的pNL4-3質(zhì)粒中插入mCherry基因，構(gòu)建mCherry與MA相融合的重組質(zhì)粒pNL4-3MA-mCherry，并通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)、純化富集、表征驗(yàn)證，獲得了具有侵染活性的mCherry熒光標(biāo)記的HIV-1病毒顆粒。分離獲取人外周血CD4+T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Lifeact質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了CD

3、4+T細(xì)胞F-actin的熒光標(biāo)記。
　　其次，在HIV-1侵染CD4+T細(xì)胞過(guò)程中，利用激光共聚焦成像技術(shù)，在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究F-actin的動(dòng)態(tài)變化及其與HIV-1病毒相互作用過(guò)程。結(jié)果表明，HIV-1的吸附導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞F-actin動(dòng)力學(xué)過(guò)程發(fā)生改變，病毒加速了F-actin的解聚、聚合過(guò)程，通過(guò)這一途徑，HIV-1病毒迅速與細(xì)胞發(fā)生膜融合，進(jìn)入細(xì)胞。
　　最后，利用超分辨SIM成像技術(shù)，進(jìn)一步超分辨研究了H

4、IV-1侵染CD4+T細(xì)胞過(guò)程中F-actin的動(dòng)態(tài)變化和相互作用過(guò)程。與寬場(chǎng)熒光顯微成像相比，超分辨SIM模式成像分辨率有顯著提高，通過(guò)這種方式，我們能夠更加精細(xì)的分析F-actin的解聚和聚合變化過(guò)程及其與病毒的相互作用。
　　綜上，本研究實(shí)現(xiàn)了HIV-1病毒與CD4+T細(xì)胞F-actin相互作用的單細(xì)胞動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)超分辨成像，解析了病毒侵染與F-actin解聚、聚合過(guò)程的相互作用關(guān)系，對(duì)深入理解HIV-1侵染CD4+T細(xì)胞的過(guò)程