沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白SseF與宿主細胞TIP60相互作用機制的研究.pdf

1、沙門氏菌是一種兼性胞內菌,它能夠在細胞內一種膜性結構中存活和繁殖,這種膜性結構稱為包裹沙門氏菌的液泡(salmonella containing vacuoles,SCV),SCV膜的完整性及在細胞中的遷移與沙門氏菌的致病機理密切相關。細胞內的沙門氏菌通過一種蛋白分泌系統(tǒng),稱之為Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion isystem,TTSS),分泌和轉運一批效應蛋白,在細菌與宿主相互作用的過程中發(fā)揮重要的作用。在感染細胞后所分

2、泌的效應蛋白中,SifA,SseF和SseG對于維持SCV膜的完整性及在細胞內的運輸和定位過程中發(fā)揮至關重要的作用。已有的研究表明SifA通過調控液泡膜募集驅動蛋白進而調控SCV的定向遷移,但是對于SseF的作用機制尚不清楚,因此本課題設計實驗尋找與SseF相互作用的宿主細胞蛋白,并進一步分析其機制。
　　為了尋找宿主細胞中SseF的靶蛋白,首先構建SseF的全長釣餌表達質粒,利用酵母雙雜交實驗,通過順序轉化的方式轉化酵母菌AH1

3、09,篩選人腎cDNA文庫,沒有找到相互作用蛋白,分析原因可能由于SseF蛋白結構中含有三個高度疏水的跨膜結構影響了其在酵母細胞中的定位,從而影響雙雜交結果,因此構建了SseF的截短突變體釣餌表達質粒再次篩選人腎cDNA文庫,發(fā)現SseF能夠與宿主細胞乙?；D移酶TIP60特異性相互作用,這種相互作用進一步經pull-down實驗驗證。為了確定SseF與TIP60相互作用的功能域,構建了一系列SseF的截短突變體,經酵母雙雜交及pull

4、-down實驗表明SseF50-66足以和TIP60相互作用。
　　為了探討SseF和TIP60相互作用的分子機制,首先驗證SseF是否作為TIP60的底物,構建了SseF和TIP60的原核表達質粒,利用組蛋白乙?；D移酶實驗(histone acetyltranseferse assay,HAT assay)發(fā)現SseF能被TIP60乙?；揎?。組蛋白乙酰基轉移酶活性缺失突變的TIP60不能使SseF乙?；揎?。進一步做點突變分

5、析表明SseF第25位的賴氨酸是TIP60發(fā)生乙?；揎椀奶禺愋晕稽c。
　　為了探討SseF的乙?；瘜ζ涔δ艿挠绊?首先利用同源重組方法構建了沙門氏菌染色體.sseF全長缺失突變株和潛在乙?；稽c點突變株,分別使用個突變株和野生株感染巨噬細胞,利用慶大霉素保護實驗計算感染12小時后細菌在巨噬細胞中的增殖率,結果顯示,在染色體突變sseF潛在乙酰化位點后,發(fā)現沙門氏菌在巨噬細胞中的增殖率較野生株相比降低了約50％,此點突變株的表型與

6、sseF全長缺失突變株表型類似。這些數據提示SseF的乙酰化修飾與其功能的發(fā)揮密切相關:進一步利用RNA干擾技術降低宿主細胞TIP60的表達并觀察對沙門氏菌感染細胞后相關表型的影響,構建了siRNATIP60干擾載體,并通過蛋白免疫印跡技術和免疫熒光確定了siRNATIP60干擾載體的感染效率。沙門氏菌分別感染干擾載體處理的Hela細胞和巨噬細胞并觀察宿主細胞TIP60的表達對沙門氏菌感染相關表型的影響。結果顯示,降低宿主細胞中TIP6

7、0的表達后,沙門氏菌感染的Hela細胞內觀察不到Sifs的形成,并且沙門氏菌在巨噬細胞中的增殖率顯著降低。這些實驗數據表明沙門氏菌感染宿主細胞后,其分泌的效應蛋白SseF通過與宿主細胞乙酰基轉移酶TIP60特異性相互作用并被乙?；揎?并且SseF的乙酰化修飾與其功能的發(fā)揮密切相關。
　　綜上所述,本研究首次發(fā)現沙門氏菌感染宿主細胞后,其分泌的效應蛋白SseF能夠與宿主細胞的組蛋白乙酰基轉移酶TIP60特異性相互作用并且被乙?；?/p>