人乳鐵蛋白基因乳腺表達載體構(gòu)建及細胞表達.pdf

1、　　β-乳球蛋白(BLG)是反芻動物最主要的乳清蛋白，在人和嚙齒動物乳中都不存在?；|(zhì)結(jié)合區(qū)是真核基因組的DNA序列中能特異地和核基質(zhì)緊密結(jié)合的區(qū)域，它廣泛地存在于從酵母到人的所有真核生物基因組中。本試驗以山羊β-乳球蛋白基因(BLG)5′端的調(diào)控序列為啟動子和人基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MARs)序列為增強子，構(gòu)建了人乳鐵蛋白乳腺特異性表達載體。然后利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞。通過G418篩選細胞，為本實驗室利用核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因

2、動物提供細胞來源。結(jié)果如下：　　1.利用PCR方法克隆了山羊BLG基因5′端的調(diào)控序列(2248bp)，其中包括第一外顯子和第一內(nèi)含子。然后將其克隆在pMD18-TVector的T位點。測序表明，克隆序列和原序列同源性為99.70﹪，其中在-684處缺失堿基C，在一860處堿基G突變?yōu)锳。Blast分析表明，克隆的山羊BLG基因的調(diào)控區(qū)和綿羊的BLG基因調(diào)控區(qū)同源性為96.09﹪，和奶牛的BLG基因的A型和B型基因的同源性分別為90.

3、55﹪和91.79﹪?！　?.將克隆的山羊BLG基因5′端調(diào)控序列連接在真核表達載體pEGFP-C1，取代原來表達載體上的啟動子CMV，構(gòu)建pBLG-GFP乳腺表達載體。將pBLG-GFP乳腺表達載體用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞，48h后熒光顯微鏡檢測報告基因表達，發(fā)現(xiàn)報告基因有良好的表達。證明了克隆的山羊BLG基因5′端調(diào)控序列的有效性和合理性?！　?.用AseⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pBLG和真核表達載體pEGFP-C1，

4、電泳后回收目的片斷，然后T4DNAligase連接，得到初級載體pEB。再用HindⅢ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pLF和pEB，電泳后回收目的片斷，然后T4DNAligase連接，得到中間表達載體pBL。最后用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒pBL和pMR，電泳后回收目的片斷，然后T4DNAligase連接，得到最終表達載體pBLM。此載體含有調(diào)控成分、目的基因、人基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列和抗性基因?！　?.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞，G41