乳鐵蛋白對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖遷移分化的影響.pdf

1、研究旨在探討LF對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖遷移分化的影響，以及LF對(duì)經(jīng)LPS刺激的人牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響，初步探索LF在促進(jìn)牙周組織修復(fù)方面的作用，為臨床上新的牙周病治療方法提供理論依據(jù)。
　　第一章:人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定
　　目的:
　　體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs），觀察體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞的形態(tài)特征及其鑒定。
　　方法:
　

2、　1.取15～22歲因正畸需要拔除的健康前磨牙，要求牙體牙周牙髓健康，拔出時(shí)無污染。
　　2.免疫組化SP（streptavidin-perosidase）法抗波形絲蛋白、角蛋白染色。
　　3.取第3代hPDLCs，消化成密度為1×106 mL-1的細(xì)胞懸液，分別加入小鼠抗人CD29、CD44、CD105、CD90單抗，室溫孵育1h;洗滌后加入羊抗鼠Ig-FITC，室溫下避光45min;洗滌后棄上清，加PBS重懸，流式細(xì)胞儀

3、檢測細(xì)胞分子表型。
　　4.MTT法檢測hPDLCs活性。
　　5.茜素紅染色法檢測hPDLCs的礦化能力。
　　結(jié)果:
　　1.組織塊酶消化法分離培養(yǎng)hPDLCs成活率較高。
　　2.SP法抗波形絲蛋白、角蛋白染色結(jié)果顯示，波形絲蛋白染色后細(xì)胞質(zhì)深染，顯陽性;角蛋白染色胞質(zhì)淺染，為陰性。
　　3.流式細(xì)胞儀分析hPDLCs分子表型顯示:CD29、CD44、CD90、CD105標(biāo)志的陽性細(xì)胞率分別為9

4、8.17％、99.13％、100％和78.21％，與結(jié)果2共同表明所培養(yǎng)細(xì)胞為間充質(zhì)來源。
　　4.hPDLCs接種第3d細(xì)胞增長迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第5～7d處于平臺(tái)期，符合成纖維細(xì)胞生長規(guī)律。
　　5.礦化誘導(dǎo)14d的hPDLCs，茜素紅染色后顯微鏡下可見若干大小不等的紅褐色結(jié)節(jié)形成。
　　第二章:乳鐵蛋白對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖、遷移的影響
　　目的:
　　采用MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell法分別

5、檢測乳鐵蛋白對(duì)hPDLCs增殖、遷移的影響，探討乳鐵蛋白是否能夠促進(jìn)hPDLCs的增殖和遷移。
　　方法:
　　1.人牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)同第一章。
　　2.將第3代HPDLCs按5×104mL-1的密度接種至96孔板，同時(shí)將培養(yǎng)基更換為含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL LF的完全培養(yǎng)基，按培養(yǎng)及成分不同分組，每組6個(gè)復(fù)孔，分別在接種后的第1d、3d、5d、7d進(jìn)行MTT檢測。
　　3.取第3代生長良

6、好的hPDLCs，以5×104mL-1接種于6孔板，待細(xì)胞長至80％～90％后，用200μL規(guī)格槍頭沿尺子在6孔板底部劃出1mm寬劃痕，并標(biāo)記觀測點(diǎn)。
　　4.取第3代生長良好的hPDLCs，以5×104mL-1密度接種至Transwell上室，用不含血清的培養(yǎng)基將體積調(diào)至200μL，下室分別加入含0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL LF的完全培養(yǎng)基500μL，每組3個(gè)復(fù)孔，孵育24h后棄去小室液體，用棉簽擦去上室未遷移

7、細(xì)胞，4％多聚甲醛固定10min，1％結(jié)晶紫染色15min，PBS溶液沖洗，200倍視野下隨機(jī)選取5處，讀取細(xì)胞個(gè)數(shù)并計(jì)算均值。
　　結(jié)果:
　　1.MTT法結(jié)果顯示三組細(xì)胞生長曲線均呈“S”形。
　　2.經(jīng)過24 h培養(yǎng)，各組細(xì)胞均向空白劃痕處遷移，但0μg/mL LF組遷移速度較慢。
　　3.Transwell法結(jié)果顯示，24h后10μg/mL、20μg/mLLF組的遷移細(xì)胞數(shù)量均高于0μg/mL LF組，差

8、異具有顯著性(P＜0.05）。
　　第三章:乳鐵蛋白對(duì)人牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響
　　目的:
　　通過茜素紅染色、PNPP法、qRT-PCR以及Western Blotting analysis觀察乳鐵蛋白對(duì)hPDLCs礦化結(jié)節(jié)形成以及對(duì)成骨誘導(dǎo)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，探討乳鐵蛋白是否具有促進(jìn)hPDLCs成骨分化的作用。
　　方法:
　　1.人牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)同第一章。
　　2.將第3代hPDLCs

9、按5×104mL-1的密度接種于6孔板，待細(xì)胞單層貼壁后更換完全培養(yǎng)基為含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL乳鐵蛋白的成骨誘導(dǎo)液，每組3個(gè)復(fù)孔，每3d換液1次，礦化14d后棄去培養(yǎng)液，4％多聚甲醛固定10min，1％茜素紅染色30分鐘，拍照并計(jì)算礦化結(jié)節(jié)面積。
　　3.取第3代生長良好的hPDLCs，按照5×104mL-1接種于6孔板中，待細(xì)胞單層貼壁后更換為含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL乳鐵蛋白的成

10、骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14d后使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，使用96孔板按照PNPP試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測堿性磷酸酶活性。
　　4.取第3代生長良好的hPDLCs，以5×104mL-1接種于6孔板中，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h至貼壁，分為0μg/mL乳鐵蛋白組、10μg/mL乳鐵蛋白組、20μg/mL乳鐵蛋白組加入不同濃度乳鐵蛋白，并將培養(yǎng)基換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
　　5.取第3代生長良好的hPDLCs，以5×104mL-1接種于

11、6孔板中，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h至貼壁，分別加入0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL乳鐵蛋白以及礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，14d后收集各組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總蛋白。
　　結(jié)果:
　　1.茜素紅染色結(jié)果顯示各組均有礦化結(jié)節(jié)形成，但0μg/mLLF組礦化結(jié)節(jié)面積明顯較另兩組少，差異具有顯著性。且20μg/mLLF組礦化結(jié)節(jié)面積較10μg/mLLF組大，差異具有顯著性。
　　2.PNPP法檢測堿性磷酸酶活性結(jié)果顯示10μg/

12、mLLF組與20μg/mLLF組堿性磷酸酶活性均高于0μg/mL LF組，且差異具有顯著性。
　　3.成骨相關(guān)基因的表達(dá)。
　　4.Western Blot結(jié)果顯示:10μg/mL LF組與20μg/mLLF組OCN、OPN的蛋白條帶灰度值明顯高于0μg/mL LF組，將各組灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　第四章:乳鐵蛋白對(duì)LPS刺激下人牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響
　　目的:
　　檢測在LPS刺激下hPDLCs炎

13、癥因子分泌情況以及在炎癥環(huán)境下LF對(duì)hPDLCs成骨分化的影響，從而探討LF在炎癥環(huán)境下對(duì)hPDLCs是否具有促進(jìn)成骨的作用。
　　方法:
　　1.人牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)同第一章。
　　2.取第3代生長良好的hPDLCs，以5×104mL-1接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至80％～90％時(shí)，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組，0.01μg/mLLPS組，0.1μg/mLLPS組，1μg/mLLPS組。
　　3.取第3代處于對(duì)數(shù)生長期的

14、hPDLCs，以5×104mL-1接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至80％～90％融合時(shí)，更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照之前實(shí)驗(yàn)選擇合適的LPS及LF刺激濃度，將細(xì)胞分為礦化液組，LPS+礦化液組，LPS+LF+礦化液組。
　　4.選取第3代生長良好并處于對(duì)數(shù)生長期的hPDLCs，用0.25％胰蛋白酶消化，重懸細(xì)胞，以5×104mL-1的密度接種于6孔板，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞單層貼壁后將細(xì)胞更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分組同上。
　　

15、5.選取第3代生長良好并處于對(duì)數(shù)生長期的hPDLCs，用0.25％胰蛋白酶消化，重懸細(xì)胞，以5×104mL-1的密度接種于6孔板，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞單層貼壁后將細(xì)胞更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分組同上。
　　結(jié)果:
　　1.0.01μg/mL LPS組TLR4表達(dá)量與對(duì)照組無差異。
　　2.三組細(xì)胞均可觀察到礦化結(jié)節(jié)的形成，其中LPS+LF+礦化液組礦化結(jié)節(jié)面積較大，與LPS組相比差異具有顯著性，LPS+礦化液組礦化

16、結(jié)節(jié)面積較礦化液組少，與礦化液組間差異具有顯著性;但礦化液組與 LPS+LF+礦化液組之間的差異沒有顯著性。
　　3.LPS+礦化液組ALP活性表達(dá)量最低，LPS+LF+礦化液組ALP活性表達(dá)量最高，且與LPS組相比差異具有顯著性。
　　4.Western Blot結(jié)果顯示，LPS+礦化液組OCN、OPN的蛋白表達(dá)量較OM組略有下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.通過組織塊酶消化法分離培養(yǎng)的細(xì)胞在

17、游出時(shí)間、成活率、感染率等方面均具有優(yōu)勢，細(xì)胞在傳至第7代時(shí)仍具有增殖、礦化等能力;利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面分子表型、免疫組化染色，并結(jié)合獲取組織部位證明了所培養(yǎng)的細(xì)胞為hPDLCs，來源可靠，并且具有增殖、分化的能力。
　　2.在LF的作用下，hPDLCs增殖能力較不添加LF時(shí)提高較為明顯，LF對(duì)水平遷移和垂直遷移能力均有增強(qiáng)作用，但hPDLCs的增殖和遷移并未表現(xiàn)出隨濃度的增加而提高的趨勢。
　　3.在礦化誘導(dǎo)正常狀態(tài)

18、hPDLCs過程中，LF可以促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成，提高成骨相關(guān)基因以及成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明LF具有促進(jìn)hPDLCs成骨分化的作用。其中成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)量隨著LF濃度的改變而產(chǎn)生差異，說明LF的濃度對(duì)hPDLCs成骨分化有一定影響。
　　4.LPS刺激后的hPDLCs炎癥因子分泌增加，更加符合牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中hPDLCs所處環(huán)境，在LPS刺激下發(fā)現(xiàn)通過LF的調(diào)節(jié)，hPDLCs成骨分化能力較僅有LPS刺激時(shí)有所提高。進(jìn)一步為L