人α-乳清蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá).pdf

1、α-LA是由哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞分泌的分子量較小、酸性的Ca2-結(jié)合蛋白。它是人乳汁中重要的蛋白組成成分，約占乳清蛋白總量的41％，占總蛋白含量的28％。在哺乳動(dòng)物乳腺中，α-LA作為乳糖合成酶的一個(gè)亞基通過與半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶相互作用來催化乳糖的合成。研究表明，α-LA的不同折疊突變體具有殺菌和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。目前，我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬面臨著嚴(yán)重挑戰(zhàn)，其主要原因是母豬乳數(shù)量和質(zhì)量的下降。為了解決這一問題，我們急需通過培育豬新品種來提高母

2、豬乳品質(zhì)和增加其產(chǎn)奶量。通過轉(zhuǎn)基因?qū)ⅵ?LA轉(zhuǎn)入豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，不僅提高了母豬乳汁中蛋白和乳糖含量，而且提高了其產(chǎn)奶量。
　　 本研究根據(jù)豬基因密碼子的偏愛性，對(duì)人α-LA基因的ORF序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，通過基因合成的方法獲得了優(yōu)化前LA-ORF序列和優(yōu)化后LA-opORF序列。將合成的LA-ORF和LA-opORF序列分別克隆入綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體PIRES2-ZsGreen1中，獲得了真核表達(dá)載體PIRES2-ZsGree

3、n1-LA和PIRES2-ZsGreen1-opLA。同時(shí)，將LA-ORF序列克隆入帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET32a(+)中，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-LA。將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21(DE3)后，通過對(duì)原核表達(dá)進(jìn)行條件優(yōu)化，獲得了誘導(dǎo)人α-LA表達(dá)的最佳條件。將轉(zhuǎn)化菌在IPTG濃度為0.1 mM、溫度為28℃條件下培養(yǎng)6h后，超聲波破菌、離心，獲得溶解在上清液中的α-LA，然后用Ni2+金屬螯合親和層析

4、法進(jìn)行分離純化，通過SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度和含量。將轉(zhuǎn)化菌在IPTG濃度為0.4mM、溫度為37℃條件下培養(yǎng)3.5h后，離心、超聲波破菌，獲得存在于沉淀中的α-LA包涵體。包涵體分離純化及鑒定的方法與可溶性蛋白的相同。
　　 結(jié)果表明：轉(zhuǎn)化菌經(jīng)過條件優(yōu)化，α-LA在胞內(nèi)表達(dá)的最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1mM，培養(yǎng)時(shí)間為6h。雖然LA-ORF序列在E.coli中表達(dá)了人α-LA，但是，由于LA-ORF序列所用密碼子不是