蘋果、梨鐵蛋白基因的克隆及菜豆鐵蛋白基因在轉(zhuǎn)基因蘋果和番茄植株中的表達(dá)特性研究.pdf

1、鐵蛋白是一種鐵貯藏結(jié)合蛋白，廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物中，由24個(gè)亞基組成450KD的巨大復(fù)合體，可以儲(chǔ)藏結(jié)合4500個(gè)可溶、非毒性、可利用的鐵原子，在生物體內(nèi)鐵的代謝方面起著關(guān)鍵作用。 蘋果是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的果樹，但目前關(guān)于蘋果鐵蛋白基因的克隆和表達(dá)特性的研究卻很少。本試驗(yàn)研究了蘋果和梨鐵蛋白基因和啟動(dòng)子的克隆，以及鐵蛋白基因在轉(zhuǎn)基因扣非轉(zhuǎn)基因蘋果基因組中的表達(dá)特性，對(duì)轉(zhuǎn)基因蘋果基因組中鐵蛋白基因表達(dá)的影響因素進(jìn)行了探

2、討，并利用番茄作為模式植物對(duì)外源鐵蛋白基因在轉(zhuǎn)基因蘋果基因組內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。 1.根據(jù)已報(bào)道植物鐵蛋白基因(ferritin)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR和RACE的方法從‘嘎拉’蘋果(Malus domestica Borkh.CV‘Gala’)葉片中獲得蘋果鐵蛋白基因(MdFer)的全長(zhǎng)序列。該基因已被GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，登錄號(hào)為DQ099429。該cDNA共含1043個(gè)堿基，編碼區(qū)831bp，編碼277個(gè)

3、氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，終止密碼子后有209bp左右的3’端尾隨序列區(qū)。通過(guò)GenBank同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與大豆、豇豆、擬南芥、煙草、小金海棠、小麥、水稻、玉米鐵蛋白基因氨基酸序列同源性分別為85％、83％、82％、80％、75％、74％、72％、71％。Southem雜交結(jié)果顯示，F(xiàn)erritin基因在‘嘎拉’蘋果基因組中至少有7個(gè)拷貝存在。0.5mM的檸檬酸鐵處理‘嘎拉’蘋果試管苗的莖段不同時(shí)間后的定量RT-PCR表明，該基因隨著

4、誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加，說(shuō)明‘嘎拉’蘋果的鐵蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上受鐵誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)利用Promoter Walking方法從‘嘎拉’蘋果基因組中克隆出MdFer的啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列具有G-box、BlockII、sHS等鐵蛋白基因啟動(dòng)子所共有的序列特征，并且在-83----70bp的位置與ZmFerl啟動(dòng)子的IDRS(Iron-dependent Regulation Sequence)區(qū)域同源性較高。 2．根據(jù)已

5、報(bào)道植物鐵蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR和RACE的方法從‘翠冠’梨(Pyrus pyriFolia Nakai.CV‘Cuiguan’)葉片中克隆到四種鐵蛋白基因的全長(zhǎng)序列。這四種基因已被GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，登錄號(hào)分別為DQ417207、DQ417208、DQ417209、DQ417210。第一種梨鐵蛋白基因即PPFerl的全長(zhǎng)為795bp，編碼265個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，終止密碼子后有292bp的3’端尾隨序列區(qū)；

6、第二種梨鐵蛋白基因 PpFer2的全長(zhǎng)為915bp，編碼305個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，終止密碼子后有108bp的3’端尾隨序列區(qū)；第三種梨鐵蛋白基因PpFer3的全長(zhǎng)為786bp，編碼262個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，終止密碼子后有298bp的3’端尾隨序列區(qū)；第四種梨鐵蛋白基因PpFer4的全長(zhǎng)為924bp，編碼308個(gè)氨．基酸殘基的蛋白質(zhì)，終止密碼子后有157bp的3’端尾隨序列區(qū)。四種梨鐵蛋白基因之間的核苷酸序列的同源性在58.7

7、％/90.4％之間。Southern雜交結(jié)果顯示ferritin基因在‘翠冠’梨基因組中以多拷貝形式存在。并利用Promoter Walking方法從‘翠冠’梨基因組中克隆出PpFer的啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列具有G-box、BlockII、SHS等鐵蛋白基因所共有的序列特征，并且在-130-1bp的位置與MdFer啟動(dòng)子的IDRS區(qū)域同源性較高。 3.以‘嘎拉’蘋果的葉片為轉(zhuǎn)化受體，應(yīng)用超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法將菜豆(Phase

8、olusvulgaris)鐵蛋白基因?qū)胧荏w中。實(shí)驗(yàn)表明，以0.5 W／cm<'2>的聲強(qiáng)、25℃、20 min超聲波處理的轉(zhuǎn)化效果最佳，抗性愈傷組織的比例高達(dá)24％。抗性愈傷組織經(jīng)誘導(dǎo)獲得了16個(gè)抗性株系，有11個(gè)株系表現(xiàn)出GUS陽(yáng)性，陽(yáng)性比率為2.75％。經(jīng)PCR檢測(cè)，11個(gè)GUS陽(yáng)性株系中有6個(gè)能擴(kuò)增出目的條帶；而Southern blotting實(shí)驗(yàn)表明，菜豆鐵蛋白基因在2個(gè)蘋果轉(zhuǎn)基因株系的基因組中實(shí)現(xiàn)了完整插入，并且雜交的信號(hào)

9、較強(qiáng)；但RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，外源菜豆鐵蛋白基因在2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的基因組中并未轉(zhuǎn)錄。 4.對(duì)4個(gè)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)菜豆鐵蛋白基因的‘嘎拉’蘋果GUS陽(yáng)性株系進(jìn)行了分子鑒定。經(jīng)PCR、PCR-Southern和Southern blotting實(shí)驗(yàn)表明，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系基因組中均整合了完整的目的基因，其中有2個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因植株至少整合了3個(gè)拷貝的目的基因，另2個(gè)株系至少整合了5個(gè)拷貝的目的基因。半定量式RT-PCR

10、檢測(cè)表明，外源菜豆鐵蛋白基因在4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中得到了表達(dá)。 5.以4個(gè)轉(zhuǎn)菜豆鐵蛋白基因的‘嘎拉’蘋果株系植株為材料，通過(guò)定量RT-PCR的方法檢測(cè)了外源和內(nèi)源鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，結(jié)果表明，蘋果轉(zhuǎn)基因植株外源鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與其插入的拷貝數(shù)沒(méi)有明顯的關(guān)系，可能受插入位點(diǎn)的影響；同時(shí)在鐵誘導(dǎo)條件下，外源鐵蛋白基因與內(nèi)源的鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性一致，在轉(zhuǎn)錄水平受鐵調(diào)控表達(dá)，隨著鐵誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，其mRNA表達(dá)水平逐

11、漸增加。但是外源菜豆鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量遠(yuǎn)高于內(nèi)源鐵蛋白基因的表達(dá)量，其中在非誘導(dǎo)條件下，內(nèi)外源鐵蛋白基因的表達(dá)量相差42倍。對(duì)在非誘導(dǎo)條件下的轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉三個(gè)部位鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量研究結(jié)果表明，外源萊豆鐵蛋白基因與內(nèi)源蘋果鐵蛋白基因的mRNA含量均在根部最高，莖次之，葉片最低，但外源鐵蛋白基因在根、莖、葉三個(gè)部位的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均比內(nèi)源蘋果鐵蛋白基因的高，其中葉片中外源鐵蛋白基因的mRNA含量比內(nèi)源鐵蛋白表達(dá)量高31倍，莖

12、中高14倍，根中 高4倍。 6以2個(gè)轉(zhuǎn)菜豆鐵蛋白基因呈GUS陽(yáng)性的‘粉紅908’番茄(Lycopersicon esculentumMill.Cv cFenhong 908’)抗性株系為材料，對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的分子鑒定，并對(duì)外源基因在番茄植株基因組內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了研究。PCR、PCR-Southern和Southern blotting實(shí)驗(yàn)表明，外源基因已整合到2個(gè)番茄株系基因組中，且2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系基因組中均至少整合