小鼠乳鐵蛋白cDNA克隆及其大腸桿菌和酵母表達.pdf

1、乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，廣泛存在于乳汁、唾液、眼淚等分泌物中。乳鐵蛋白除鐵結(jié)合活性外還具有多種生物學(xué)功能，包括抗菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)細胞增長、基因轉(zhuǎn)錄活化等功能，自被發(fā)現(xiàn)以來就一直是世界各國學(xué)者研究的熱點。本研究克隆了昆明種小鼠乳鐵蛋白cDNA，分別構(gòu)建了原核、真核表達載體，并完成其在大腸桿菌和畢赤酵母中的重組表達，對其活性進行測定，為乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究及其進一步規(guī)

2、?；a(chǎn)和應(yīng)用提供了依據(jù)。 本實驗從昆明種泌乳期小鼠乳腺組織中提取總RNA，通過RT-PCR得到小鼠乳鐵蛋白cDNA全序列，該序列全長2121bp，編碼一條707個氨基酸殘基的肽鏈，其中前19個氨基酸為信號肽，并對得到的小鼠乳鐵蛋白信號肽和成熟肽序列與其它10種哺乳動物進行對比，同源性都為50％以上，得到的小鼠成熟乳鐵蛋白與家鼠只存在6個氨基酸的差異，即Arg6，Met63，Ser359，Ala381，Glu420，Ala615

3、。 本實驗分別構(gòu)建了小鼠乳鐵蛋白全序列（MLF）及其N-葉（MLFN）大腸桿菌表達載體pET28a-MLF和pET28a-MLFN，實現(xiàn)了MLF及MLFN在大腸桿菌BI21（DE3）中的表達，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，分子量分別為81.73kDa和38.72kDa；變性條件下Ni2+親和層析柱純化目的蛋白，rMLF（重組MLF）和rMLFN（重組MLFN）的表達量分別為17

4、mg/L和20mg/L；包涵體體外復(fù)性產(chǎn)量分別為0.06mg/L和0.09mg/L；體外抑制金黃色葡萄球菌ATCC25923的實驗結(jié)果：與陰性對照（dH2O，1.4×107 CFUs/ml）相比，在rMLFN的處理濃度為25μmol/L時，金黃色葡萄球菌的存活率有所下降（7.2×106 CFUs/ml），而12.5μmol/L的rMLF對金黃色葡萄球菌幾乎沒有抑制作用。 進一步將小鼠乳鐵蛋白N-葉基因克隆到酵母表達載體pPICZ

5、aA中，得到pPICZaA-MLFN；在此基礎(chǔ)上，體外構(gòu)建了小鼠乳鐵蛋白N-葉2～8拷貝酵母表達載體；將pPICZaA-MLFN轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33并誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE和Western blot均檢測到39.6kDa外源蛋白的表達，0.5％甲醇誘導(dǎo)48h后，表達量最高；Ni2+親和層析柱純化產(chǎn)物，目的蛋白的得率為5mg/L；鐵結(jié)合活性分析表明rMLFN具有pH值依賴性的鐵離子結(jié)合/釋放能力，隨著pH值的下降，鐵飽和度也逐漸減小。