昆明小鼠胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、本研究的目的是建立有效的昆明小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，用于分離和培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的研究，篩選出更適合于昆明小鼠ES細(xì)胞的克隆培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步建立昆明小鼠ES細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。 1.分別選取妊娠11 d，14.5 d和16 d的孕鼠胎兒分離成纖維細(xì)胞，比較分離不同日齡胎兒的成纖維細(xì)胞增殖及純化情況，以及觀察不同接種密度，成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)生長狀況。選擇成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)的最適胚齡和最佳培養(yǎng)條件。試驗

2、結(jié)果顯示，14.5 d的孕鼠胎兒分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞效果最好。可分離到大量的成纖維細(xì)胞，雜細(xì)胞少，并且細(xì)胞增殖快。生長旺盛、已純化的第三代成纖維細(xì)胞最適宜做ES細(xì)胞的飼養(yǎng)層。 2.采用全胚培養(yǎng)法，比較桑椹胚和囊胚對ES細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響。將桑椹胚和囊胚分別培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上，桑椹胚的貼壁率、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)增殖率和ES細(xì)胞集落的出現(xiàn)率均顯著低于囊胚(P<0.01)。由此看出，試驗中獲得的小鼠囊胚更適合作為ES細(xì)胞分離克隆的材料，并且

3、妊娠第4天采集的胚胎囊胚率高。 3.比較三種不同濃度消化液：0.25％胰酶+0.04％EDTA，0.05％胰酶+0.04％EDTA和0.02％胰酶+0.01％EDTA，對內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、ES細(xì)胞集落分離克隆的影響。試驗結(jié)果顯示，0.02％胰酶+0.01％EDTA是較好的ES細(xì)胞消化液，對細(xì)胞的損傷力小，且傳代后ES細(xì)胞集落形成能力也較高；對沒有消化離散的大的細(xì)胞團(tuán)塊，吸出后用機(jī)械法切割。 4.選取生長旺盛并且已純化的第3代成纖

4、維細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素-C處理后，用細(xì)胞計數(shù)板計算細(xì)胞數(shù)，分別按密度為1×104個/mL，1×106個/mL和1×108個/mL接種，制備飼養(yǎng)層，觀察不同密度飼養(yǎng)層的生長狀況和不同密度飼養(yǎng)層上囊胚、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及胚胎干細(xì)胞的克隆生長情況。試驗結(jié)果表明，囊胚在密度為1×106個/mL的飼養(yǎng)層上，貼壁率和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)孵出率分別為(97.04±3.606)％，(96.3±2.887)％，顯著高于其他兩組；密度為1×106個/mL飼養(yǎng)層上的ES細(xì)胞克隆形成

5、率高于密度為1×104個/mL(差異極顯著，P<0.01)和1×100個/mL飼養(yǎng)層上的ES細(xì)胞克隆形成率差異顯著(P<0.05)；而1×104個/mL飼養(yǎng)層和1×108個/mL飼養(yǎng)層上的ES細(xì)胞克隆形成率差異不顯著(P>0.05)。因此，以1×106個/mL密度接種的成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，最適合用于分離培養(yǎng)昆明小鼠ES細(xì)胞，有利于囊胚的發(fā)育、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的增殖、促進(jìn)ES細(xì)胞的增殖，并起到抑制其分化的作用。 5.對分離克隆出的ES細(xì)