人胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及建系.pdf

1、自1998年Thomson和Gearhart兩個小組分別報道他們用不同材料，不同方法成功分離建立了具有多方向潛能和永久增殖能力的人胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)系和人胚胎生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)系(二者統(tǒng)稱為人胚胎干細(xì)胞系)以來，在美國NIH登記的人類ES細(xì)胞系已達(dá)78株，但真正能供其他實驗室做研究的細(xì)胞僅10株。我國僅中山大學(xué)、中南大學(xué)、北京大學(xué)有人胚胎干細(xì)胞建系的報道。 人胚胎干細(xì)胞被用于研究胚胎早期發(fā)育，作為器官移植來源為臨床應(yīng)用提供

2、極大的可能性。人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)依賴飼養(yǎng)細(xì)胞，目前大多使用胚胎鼠源成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，因此，在培養(yǎng)過程中存在異種細(xì)胞、蛋白和不明病原微生物污染的可能，這將是胚胎干細(xì)胞應(yīng)用到臨床需要克服的障礙之一。我們利用IVF中心已實施助孕技術(shù)夫婦捐獻的冷凍胚胎及5-9周藥物流產(chǎn)胎兒探討人胚胎干細(xì)胞建系方法；并以子宮內(nèi)膜細(xì)胞為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)人原始生殖細(xì)胞，觀察其生長特性及分化能力，以建立一個全部來源于人類細(xì)胞的全新的胚胎干細(xì)胞系，為將來臨床的應(yīng)用提供

3、安全的保障。 方法： 一、hES細(xì)胞系的建立 1.胚胎干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 行IVF/ICSI助孕患者自愿捐獻的冷凍胚胎，捐贈者知情同意和醫(yī)院倫理委員會討論通過后，復(fù)蘇冷凍的胚胎，用G1.3G2.3序貫培養(yǎng)法培養(yǎng)至囊胚，采用免疫外科法分離內(nèi)細(xì)胞團，將其接種在胚胎鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進行培養(yǎng)，直至干細(xì)胞集落出現(xiàn)。用機械法、膠原酶、胰酶法、Dispase法對ES細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)。為了保持hES的穩(wěn)定性，早期用機

4、械法離散為大約100個hES細(xì)胞的小簇，接種到新的飼養(yǎng)層上。 2.人類胚胎干細(xì)胞的特性的檢測 利用堿性磷酸酶試劑盒NBT/BCIP檢測胚胎干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。用免疫熒光和共聚焦顯微鏡檢測SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-81、TRA-1-60、OCT-4等胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志。細(xì)胞遺傳學(xué)分析：用秋水仙素處理hES細(xì)胞3～4小時，胰蛋白酶消化，用甲醇：冰醋酸(methanol：gla-cial)(3:1)固定，Gi

5、emsa染色，分析。 擬胚體的形成和體外分化實驗：融合的在胚胎干細(xì)胞集落(約106個細(xì)胞)用膠原酶消化，用擬胚體培養(yǎng)液(撤除LIF)在細(xì)菌培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)。將形成的擬胚體置于低熔點瓊脂中，石蠟包埋，切片，用免疫組化法檢測mus-cle-specific actin(MSA)，nestin，pan-cytokeratin。 體內(nèi)分化實驗：培養(yǎng)5天的hES克隆用膠原酶消化，收集hES細(xì)胞，用25G針將細(xì)胞懸液注入SCID鼠后腿

6、皮下，注射10周后，處死，石蠟包埋，切片，觀察。 二、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)人胚原始生殖細(xì)胞標(biāo)本 取在沈陽市婦嬰醫(yī)院行子宮切除術(shù)患者自愿捐獻的子宮內(nèi)膜及行藥物流產(chǎn)患者自愿捐獻的受精5～9周流產(chǎn)胎兒，捐獻者知情同意，且倫理委員會通過。 1.子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 將子宮內(nèi)膜組織用D-Hank's液沖洗，剪碎，用0.1％膠原酶IV室溫條件下消化，用Pasteur吸管反復(fù)抽吸、吹打，加人培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸

7、液。調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：絲裂霉素C處理培養(yǎng)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞2.5～3小時后換新鮮培養(yǎng)液待用。 2.原始生殖細(xì)胞(PGC)的分離與培養(yǎng) 受精4～9孕周人胚胎，從胚體背側(cè)撕下兩旁的生殖嵴和腸系膜，剪碎；用0.25％胰蛋白酶消化，終止消化，用吸管移人預(yù)先用明膠包被培養(yǎng)皿內(nèi)，加DMEM培養(yǎng)液。置于37℃、5％CO2、95％濕度條件下培養(yǎng)。以后每1～2天更換培養(yǎng)液，每

8、7～8天用0.1％膠原酶或0.25％胰蛋白酶傳代。 3.EG細(xì)胞生物學(xué)特性的檢測 利用堿性磷酸酶試劑盒NBT/BCIP檢測胚胎干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。用免疫熒光和共聚焦顯微鏡檢測SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-81、TRA-1-60、OCT-4等胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志。細(xì)胞遺傳學(xué)分析：用秋水仙素處理hES細(xì)胞3～4小時，胰蛋白酶消化，用甲醇：冰醋酸(3:1)固定，Gi-emsa染色，分析。 擬胚體的形成和體外

9、分化實驗：融合的100mm皿(約106個細(xì)胞)用膠原酶消化，用擬胚體培養(yǎng)液(撤除LIF)在細(xì)菌培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)。將形成的擬胚體置于低熔點瓊脂中，石蠟包埋，切片，用免疫組化法檢測muscle-specific actin(MSA)，nestin，pan-cytokeratin。 體內(nèi)分化實驗：取已經(jīng)連續(xù)傳5代的2個細(xì)胞系，分別制備細(xì)胞濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液注入裸鼠兩側(cè)腹股溝處皮下。觀察8周,于第8周末處死小鼠，摘取瘤體，測

10、量大小，并行常規(guī)組織病理學(xué)檢查。 流式細(xì)胞分選：酶消化細(xì)胞，加PBS-F(98％PBS+2％FBS)離心洗滌細(xì)胞；加PBS-F，使細(xì)胞濃度成10 cell/ml，根據(jù)說明書加入適量PE標(biāo)記SSEA-4 IgM抗體及同型對照，利用FACSVantage SE上機分選。 結(jié)果: 一、hES的分離與培養(yǎng) 1.20個解凍卵裂期胚胎，獲得9個囊胚，分出完整的內(nèi)細(xì)胞團共7個，從7個內(nèi)細(xì)胞團培養(yǎng)出2個胚胎干細(xì)胞系。這兩

11、個細(xì)胞系來源的囊胚均為優(yōu)質(zhì)囊胚。 2.1-8代用機械法傳代；大量的細(xì)胞可采用膠原酶或胰酶消化傳代。三種方法比較，機械法費時、費力；克隆大小不均；膠原酶溫和，傳代后細(xì)胞活性保存較好。胰酶作用強，作用時間短，細(xì)胞分散好，但較難掌控。 3.兩個系細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ分別培養(yǎng)傳代20代、18代。未分化的hES細(xì)胞克隆融合、扁平或圓形，細(xì)胞界限清楚；集落內(nèi)的細(xì)胞核大、核仁清楚，胞核與胞漿的比率高，可見1～3個核仁。 4.兩個細(xì)胞系核

12、型均正常，體外傳代4個月后核型保持穩(wěn)定。有正常的46，XX核型。 5.本研究所培養(yǎng)的2個系細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶、SSEA-3陽性、SSEA-4陽性、TRA-1-81陽性、TRA-1-60陽性、OCT-4陽性，而SSEA-1陰性。 6.hES細(xì)胞在體外培養(yǎng)4天部分開始囊性變，培養(yǎng)7～8天全部分化為囊實性結(jié)構(gòu)，成為成熟擬胚體。石蠟切片免疫組化顯示有三個胚層標(biāo)記物表達(dá)，如muscle-specific actin(MSA)，ne

13、stin，pan-cytokeratin。 7.將細(xì)胞注射人SCID-biege鼠皮下，形成腫瘤，病理切片為成熟畸胎瘤。 二、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)人胚原始生殖細(xì)胞： 1.人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞生長情況基質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)中間稍寬，兩端尖的形態(tài)，似梭形，亦有細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞核呈卵圓形，長期連續(xù)培養(yǎng)后，梭形細(xì)胞延伸成長梭形，相互平行排列成束。絲裂霉素C處理后可持續(xù)生長4周。 2.從腸系膜分離得到的PGC多，一

14、般在體外培養(yǎng)7～10天可以出現(xiàn)數(shù)個大的多層細(xì)胞集落，形似鳥巢。人EG細(xì)胞的體積較大，核質(zhì)比高，核內(nèi)有2個以上的核仁，與hES細(xì)胞相似。有一個細(xì)胞系在人子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上傳，4個半月(18代)，保持未分化狀態(tài)。 3.PGC表達(dá)胚胎干細(xì)胞的多種標(biāo)志，如堿性磷酸酶陽性、SSEA-1陽性、SSEA-3陽性、SSEA-4陽性、TRA-1-81陽性、TRA-1-60陽性、OCT-4陽性，細(xì)胞保持正常的染色體核型46，XX。

15、4.將EG細(xì)胞注射入裸鼠體內(nèi)，形成組織學(xué)檢查包括皮脂腺、脂肪、腺體及腺上皮、鱗狀上皮的成熟畸胎瘤。 5.細(xì)胞無飼養(yǎng)層懸浮培養(yǎng)7天，部分EB開始膨脹，成為囊狀擬胚體。將擬胚體切片，免疫組化結(jié)果顯示MSA、Nestin、Pan-cytokeratin呈陽性。 6.用SSEA-4直標(biāo)抗體對細(xì)胞進行流式細(xì)胞鑒定，發(fā)現(xiàn)的SSEA-4陽性細(xì)胞占15。45％。 結(jié)論： 1.本研究建立的兩個細(xì)胞系均為人類胚胎干細(xì)胞系，具