昆明小鼠胚胎干細(xì)胞建系的初步研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)是具有自我更新和高度分化潛能的細(xì)胞，能在體外保持未分化狀態(tài)無限增殖傳代。目前已建立了多種動(dòng)物和人的ESCs系。昆明系小鼠是我國生物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。故本試驗(yàn)以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，探討了小鼠ESCs(mouse ESCs，mESCs)建系的技術(shù)方法，為實(shí)驗(yàn)室下一步研究水牛ESCs建系提供一套可行的技術(shù)理論體系。 本試驗(yàn)包括兩部分內(nèi)容，第一部分為類mESCs分離

2、方法的研究。主要探討不同胚胎期(擴(kuò)展囊胚和孵化囊胚)和傳代方法對分離類mESCs效率的影響。第二部分為類mESCs鑒定的研究。包括堿性磷酸酶(AKP)染色、RT-PCR分析Oct4和Sox2表達(dá)、核型分析和分化能力鑒定。其中檢測類mESCs分化能力又通過自發(fā)分化和bFGF誘導(dǎo)分化兩方面進(jìn)行。 結(jié)果顯示：1)擴(kuò)展囊胚分離類mESCs效率高于孵化囊胚(P<0.05)。雖然在貼壁率和原代克隆形成率二者沒有顯著差異(P>0.05)，但在

3、孵化囊胚組未獲得類mESCs；2)從類mESCs生長形態(tài)和AKP染色上看，5代后類mESCs傳代使用機(jī)械法或Trypsin/EDTA消化法，對維持類mESCs未分化狀態(tài)沒有差異，說明無論機(jī)械法還是Trypsin/EDTA消化法都適合對類mESCs進(jìn)行傳代；3)本實(shí)驗(yàn)獲得的類mESCs傳至25代未見形態(tài)上的分化，AKP染色呈強(qiáng)陽性，RT-PCR分析顯示表達(dá)Oct4和Sox2，核型分析顯示為正常核型40XY，正常核型率為70％，說明本試驗(yàn)分

4、離的類mESCs具有ESCs的基本特征；4)類mESCs在去除飼養(yǎng)層和LIF、bFGF之后，經(jīng)懸浮培養(yǎng)形成類胚體(EB)，EB貼壁后在無LIF、bFGF下自發(fā)分化為多種類型細(xì)胞； 在無LIF、血清以及含20 ng/mL bFGF下誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞；AKP染色顯示，這兩種方式分化的細(xì)胞均呈陰性；用Nestin檢測誘導(dǎo)分化，呈陽性。說明類mESCs具有體外分化潛能。 綜上所述，本試驗(yàn)成功分離出類mESCs，而且所分離的類m