昆明小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化.pdf

1、本試驗旨在研究不同的培養(yǎng)方法、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞因子、肝素鈉、溫度、氧分壓等因素對昆明小鼠胚胎干細(xì)胞建系的影響，篩選了昆明小鼠胚胎干細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件，并以此為基礎(chǔ)建立了攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的小鼠胚胎干細(xì)胞系。
　　 試驗利用兩種不同的培養(yǎng)體系（KSR和N2B27）建立昆明小鼠胚胎干細(xì)胞。結(jié)果在KSR的培養(yǎng)體系中小鼠胚胎干細(xì)胞集落貼壁狀態(tài)生長，生長較緩慢，邊緣細(xì)胞分化脫落，最高傳代為6代；在N2B27培養(yǎng)體系中細(xì)胞集落呈

2、懸浮狀態(tài)生長，生長較快，邊緣光滑整齊，連續(xù)傳7代未見分化。
　　 采用N2B27基本培養(yǎng)體系。研究不同基礎(chǔ)培養(yǎng)液（高糖DMEM、knockout DMEM、DMEM/F12、TCM-199）、細(xì)胞因子（LIF、bFGF、EGF）、兩種藥物（SU5402、肝素鈉）、溫度和氣相環(huán)境等因素對昆明小鼠胚胎干細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基knockout DMEM和DMEM/F12優(yōu)于高糖DMEM和TCM-199；LIF對小鼠胚胎干細(xì)胞

3、生長具有明顯的促進(jìn)作用(P<0.01)；bFGF、EGF、肝素鈉對小鼠胚胎干細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用(P<0.05)；SU5402對小鼠胚胎干細(xì)胞沒有明顯的促進(jìn)作用(P>0.05)；溫度39℃比37℃更有利于小鼠胚胎干細(xì)胞的快速增殖，氧分壓20% O2較氧分壓5% O2有利于小鼠胚胎干細(xì)胞的建系。
　　 以N2B27系統(tǒng)為條件，采用卵周隙注射攜帶GFP基因的慢病毒載體法感染早期小鼠胚胎，再將轉(zhuǎn)染小鼠胚胎接種在N2B27胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)