USP7穩(wěn)定Ki-67蛋白促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖的機(jī)制與意義.pdf

1、研究背景和目的：
　　USP7作為一個(gè)去泛素酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著一定的作用；Ki-67作為一個(gè)細(xì)胞增殖的標(biāo)記分子，同時(shí)也參與促進(jìn)腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。我們?cè)诜切〖?xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)USP7能夠調(diào)控Ki-67促進(jìn)癌癥的發(fā)展。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)正常肺組織和NSCLC組織中USP7表達(dá)；應(yīng)用Western blot、Real-time PCR方法檢測(cè)人正常肺上皮細(xì)胞Beas2B和NSCLC細(xì)胞

2、中USP7蛋白和mRNA；通過在NSCLC細(xì)胞中用USP7活性抑制劑P22077及轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒干預(yù)后，運(yùn)用CCK8和AO-EB雙熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖和存活狀態(tài)。
　　2.在NSCLC細(xì)胞中用P22077及轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒干預(yù)后，通過Western blot檢測(cè)MCM2、PCNA蛋白表達(dá)，通過細(xì)胞免疫熒光（CIF）檢測(cè)Ki-67蛋白表達(dá)；運(yùn)用CIF檢測(cè)人正常肺上皮細(xì)胞Beas2B和NSCLC細(xì)胞中Ki

3、-67蛋白表達(dá)；運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)正常肺組織和NSCLC組織中Ki-67表達(dá)；通過裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒的A549細(xì)胞增殖成瘤體積。
　　3.通過Real-time PCR檢測(cè)人正常肺上皮細(xì)胞Beas2B和NSCLC細(xì)胞中Ki-67mRNA表達(dá)和在NSCLC細(xì)胞中用P22077及轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒干預(yù)后，Ki-67mRNA的表達(dá)情況；應(yīng)用CIF，在NSCLC細(xì)胞中檢測(cè)USP7與Ki-67

4、的定位情況；應(yīng)用MG132及轉(zhuǎn)染USP7 C223A突變質(zhì)粒后，進(jìn)一步研究USP7對(duì)Ki-67的調(diào)控機(jī)制；通過CCK8實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒后細(xì)胞對(duì)藥物敏感性影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.在NSCLC組織中USP7在核內(nèi)高表達(dá)，并且分化程度越低的組織表達(dá)越高；與Beas2B細(xì)胞相比NSCLC細(xì)胞中USP7的蛋白和mRNA均高表達(dá)；應(yīng)用P22077及轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒檢測(cè)NSCLC細(xì)胞的增殖效率降低

5、，細(xì)胞保持存活狀態(tài)。
　　2.在NSCLC細(xì)胞中應(yīng)用P22077和轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒后MCM2、PCNA的蛋白表達(dá)不變，Ki-67蛋白表達(dá)減少；與Beas2B細(xì)胞相比NSCLC細(xì)胞中Ki-67的蛋白高表達(dá)；在NSCLC組織中Ki-67也在核內(nèi)高表達(dá)，并且分化程度越低的組織表達(dá)越高；在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒后，細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤與對(duì)照組和NC組比瘤體體積減少顯著。
　　3.在Beas2B和NSCL

6、C細(xì)胞Ki-67的mRNA基本一致，在NSCLC細(xì)胞中應(yīng)用P22077、轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒后，Ki-67 mRNA保持不變；在NSCLC細(xì)胞中USP7和Ki-67有共定位現(xiàn)象；MG132拮抗P22077所誘導(dǎo)對(duì)Ki-67蛋白表達(dá)下調(diào)作用，應(yīng)用MG132后在轉(zhuǎn)染USP7 siRNA細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)恢復(fù)；過表達(dá)USP7 C223A后，Ki-67蛋白表達(dá)減少；轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒的細(xì)胞對(duì)藥物敏感性無變化，甚至還有所提