USP7穩(wěn)定Ki-67蛋白促進NSCLC細胞增殖的機制與意義.pdf

1、研究背景和目的：
　　USP7作為一個去泛素酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮著一定的作用；Ki-67作為一個細胞增殖的標記分子，同時也參與促進腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。我們在非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)USP7能夠調(diào)控Ki-67促進癌癥的發(fā)展。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用免疫組織化學方法檢測正常肺組織和NSCLC組織中USP7表達；應(yīng)用Western blot、Real-time PCR方法檢測人正常肺上皮細胞Beas2B和NSCLC細胞

2、中USP7蛋白和mRNA；通過在NSCLC細胞中用USP7活性抑制劑P22077及轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒干預后，運用CCK8和AO-EB雙熒光染色法檢測細胞的增殖和存活狀態(tài)。
　　2.在NSCLC細胞中用P22077及轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒干預后，通過Western blot檢測MCM2、PCNA蛋白表達，通過細胞免疫熒光（CIF）檢測Ki-67蛋白表達；運用CIF檢測人正常肺上皮細胞Beas2B和NSCLC細胞中Ki

3、-67蛋白表達；運用免疫組織化學方法檢測正常肺組織和NSCLC組織中Ki-67表達；通過裸鼠皮下移植瘤實驗檢測轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒的A549細胞增殖成瘤體積。
　　3.通過Real-time PCR檢測人正常肺上皮細胞Beas2B和NSCLC細胞中Ki-67mRNA表達和在NSCLC細胞中用P22077及轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒干預后，Ki-67mRNA的表達情況；應(yīng)用CIF，在NSCLC細胞中檢測USP7與Ki-67

4、的定位情況；應(yīng)用MG132及轉(zhuǎn)染USP7 C223A突變質(zhì)粒后，進一步研究USP7對Ki-67的調(diào)控機制；通過CCK8實驗，檢測轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒后細胞對藥物敏感性影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.在NSCLC組織中USP7在核內(nèi)高表達，并且分化程度越低的組織表達越高；與Beas2B細胞相比NSCLC細胞中USP7的蛋白和mRNA均高表達；應(yīng)用P22077及轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒檢測NSCLC細胞的增殖效率降低

5、，細胞保持存活狀態(tài)。
　　2.在NSCLC細胞中應(yīng)用P22077和轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒后MCM2、PCNA的蛋白表達不變，Ki-67蛋白表達減少；與Beas2B細胞相比NSCLC細胞中Ki-67的蛋白高表達；在NSCLC組織中Ki-67也在核內(nèi)高表達，并且分化程度越低的組織表達越高；在A549細胞中轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒后，細胞裸鼠皮下移植瘤與對照組和NC組比瘤體體積減少顯著。
　　3.在Beas2B和NSCL

6、C細胞Ki-67的mRNA基本一致，在NSCLC細胞中應(yīng)用P22077、轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒后，Ki-67 mRNA保持不變；在NSCLC細胞中USP7和Ki-67有共定位現(xiàn)象；MG132拮抗P22077所誘導對Ki-67蛋白表達下調(diào)作用，應(yīng)用MG132后在轉(zhuǎn)染USP7 siRNA細胞中Ki-67蛋白表達恢復；過表達USP7 C223A后，Ki-67蛋白表達減少；轉(zhuǎn)染USP7 siRNA質(zhì)粒的細胞對藥物敏感性無變化，甚至還有所提