核蛋白STIP介導(dǎo)去泛素化酶USP7分子調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、STIP是一種核磷酸化蛋白，過(guò)表達(dá)時(shí)在核中能自我聚集成rod樣的大分子結(jié)構(gòu)——stiposome。STIP在人體內(nèi)的多個(gè)器官，如腎，肝，肺等，以及各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，且從線蟲到人高度同源，它的表達(dá)受到干擾后，會(huì)使胚胎發(fā)育停止在16細(xì)胞階段，說(shuō)明STIP在生物進(jìn)化中具有非常重要的保守功能。然而，至今STIP在細(xì)胞內(nèi)的功能和作用機(jī)制仍然知之甚少。
　　USP7屬于半胱氨酸蛋白酶，是泛素特異性蛋白酶家族的重要成員之一，是首個(gè)被確認(rèn)的p

2、53底物特異性去泛素化蛋白酶。USP7可以直接結(jié)合并去泛素化p53，穩(wěn)定p53。同時(shí)，USP7還能結(jié)合并去泛素化p53的負(fù)調(diào)控子E3泛素連接酶Mdm2，穩(wěn)定Mdm2。結(jié)構(gòu)和生化研究揭示Mdm2與USP7的親和力明顯高于p53數(shù)倍，是USP7在非應(yīng)激的條件下優(yōu)先結(jié)合的底物。此外，USP7還能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白底物的活性和功能，包括抑瘤蛋白、DNA修復(fù)蛋白、免疫應(yīng)答蛋白、病毒蛋白、表觀遺傳調(diào)節(jié)子等，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

3、　　前期研究我們發(fā)現(xiàn)STIP通過(guò)減少M(fèi)dm2和p53的泛素化，延長(zhǎng)Mdm2和p53蛋白的半衰期，導(dǎo)致Mdm2和p53蛋白的穩(wěn)定，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于STIP并不具有任何酶的活性和功能，為了揭示其介導(dǎo)Mdm2和p53穩(wěn)定的分子機(jī)制，我們首先通過(guò)生物信息學(xué)的方法，分析了STIP的蛋白序列上可能結(jié)合的蛋白，發(fā)現(xiàn)STIP蛋白序列上有多個(gè)去泛素化酶USP7的結(jié)合位點(diǎn)，提示STIP與USP7很可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，我們采

4、用激光共聚焦顯微鏡，通過(guò)間接免疫熒光的方法，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性STIP與USP7共定位于細(xì)胞核內(nèi)stiposome。進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和GSTp(μ)ll-down實(shí)驗(yàn)，明確STIP與USP7在細(xì)胞內(nèi)直接相互作用。為了揭示STIP結(jié)合于USP7的部位，我們將不同刪除區(qū)段的USP7質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，USP7的N端和C端介導(dǎo)了與STIP的結(jié)合。USP7作為去泛素化酶不僅能去泛素化并穩(wěn)定p53，而且也能去泛素化并穩(wěn)定它的

5、負(fù)調(diào)控子Mdm2，為了明確STIP是否通過(guò)USP7來(lái)調(diào)控Mdm2和p53的穩(wěn)定，我們分別通過(guò)過(guò)表達(dá)USP7、干擾USP7的表達(dá)以及突變USP7的酶活性功能區(qū)等策略，證明STIP穩(wěn)定Mdm2和p53依賴于USP7去泛素化酶的活性和功能。本文通過(guò)上述研究，揭示了STIP穩(wěn)定Mdm2和P53的分子機(jī)制，明確了STIP是介導(dǎo)USP7對(duì)Mdm2和p53調(diào)控的新分子，不僅有助于豐富Mdm2-p53通路分子調(diào)控的理論，而且為進(jìn)一步探討STIP在腫瘤中