肺部CD103+DC在過敏性哮喘過程中作用的初步研究.pdf

1、目的：
　　利用免疫佐劑明礬（Aluminium hydroxide,ALUM）與雞卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）腹腔致敏小鼠，并聯(lián)合OVA霧化誘導小鼠過敏性哮喘，研究肺部CD103+DC在過敏性哮喘中作用。
　　利用C57BL/6、Batf3-/-缺陷鼠和CD11c-DTR小鼠來研究肺部CD103+DC在過敏性哮喘中的作用。本論文主要以分子與細胞免疫學、免疫組織化學方法，研究在過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展過程中，肺部CD10

2、3+DC在獲得性免疫反應中功能的變化，以明確其可能的作用機制。為探索過敏性哮喘等呼吸系統(tǒng)相關疾病的發(fā)病機制、預防、藥物過敏提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　首先，選用7-8周雌性C57BL/6小鼠，以免疫佐劑明礬（alum）加入雞卵清蛋白（OVA），震蕩混勻充分乳化OVA后，給予小鼠腹腔注射做初次致敏，第14天再次相同劑量進行第二次腹腔致敏，然后在28-30天之間用1％OVA連續(xù)霧化3天，每次30min，構建小鼠過敏性哮喘模型

3、。
　　其次，應用相關轉基因和基因敲除純合小鼠及其嵌合小鼠建立哮喘模型，建立Batf3-/-嵌合小鼠過敏性哮喘模型。各小組小鼠連續(xù)霧化3天后，摘取眼球取血，頸椎脫臼處死，取支氣管肺泡灌洗液、肺引流淋巴結、肺臟制備單細胞，以FACS Aria Ⅱ流式細胞儀檢測相關的肺泡巨噬細胞(AM)、樹突狀細胞亞群（DCs）、淋巴細胞亞群及其相關胞內(nèi)細胞因子的表達水平；以ELISA的方法檢測灌洗液中IL4、IL-5、血清中IgG1、IgG2b表達

4、水平；以Real-time PCR檢測肺組織、肺引流淋巴結中轉錄因子和細胞因子的表達水平；對肺部組織切片進行PAS、HE染色，觀察肺部變應性炎癥反應狀態(tài)、肺部組織形態(tài)的變化情況。
　　再次，對CD11c-DTR轉基因小鼠頸椎脫臼處死，取其骨髓制單細胞懸液，尾靜脈回輸至輻照后的C57BL/6小鼠，制備CD11c-DTR嵌合鼠，8周后檢測嵌合情況，霧化前一天氣管內(nèi)注射DT清除肺部DC，建立CD11c-DTR嵌合小鼠過敏性哮喘模型。各小

5、組小鼠連續(xù)霧化3天后，摘取眼球取血，頸椎脫臼處死，取支氣管肺泡灌洗液、肺引流淋巴結、肺臟制備單細胞，以FACS Aria Ⅱ流式細胞儀檢測相關的肺泡巨噬細胞(AM)、樹突狀細胞亞群（DCs）、淋巴細胞亞群及其相關胞內(nèi)細胞因子的表達水平；以ELISA的方法檢測灌洗液中IL4、IL-5和血清中IgG1、IgG2b等的表達水平；用Real-time PCR檢測肺組織IL-4、IL-5 RNA表達水平；對肺部組織切片進行PAS、HE染色，觀察肺

6、部變應性炎癥反應狀態(tài)、肺部組織形態(tài)的變化情況。
　　最后，用體內(nèi)趨化實驗方法，取正常C57BL/6小鼠剔除背部毛發(fā)，用5ml注射器皮下注入3ml氣體，在小鼠背部形成氣泡，然后三天之后再注射一次，分選C57BL/6哮喘模型中和對照小鼠CD103+DC、CD11b+DC、AM注射到小鼠后背氣泡中，12h用PBS沖洗氣泡，用流式細胞儀檢測氣泡嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞數(shù)目。肺部趨化實驗，用流式細胞儀分選C57BL/6小鼠CD103+DC、

7、CD11b+DC氣管內(nèi)注射正常C57BL/6，48h觀察肺部嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞細胞數(shù)變化。
　　結果：
　　在C57BL/6小鼠哮喘模型中，流式細胞儀檢測肺灌洗液中單細胞懸液以及肺單細胞懸液，發(fā)現(xiàn)肺單細胞懸液以及肺灌洗液中單細胞懸液的嗜酸性粒細胞、AM、DCs、單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等細胞數(shù)，哮喘模型組比對照組顯著升高。肺部切片PAS/HE染色，在肺部呼吸道周圍炎癥細胞募集浸潤程度以及氣道粘液分泌程度上，哮喘模

8、型組比對照組在炎癥細胞浸潤程度顯著加重。ELISA方法檢測血清中IgG1的表達，發(fā)現(xiàn)哮喘模型組比對照組顯著升高，而這兩組IgG2b無差異。從而證明腹腔致敏OVA+ALUM并且OVA霧化組肺部炎癥狀態(tài)嚴重，并且明顯高于PBS陰性對照組。
　　在Batf3-/-小鼠哮喘模型中，用FACS Aria Ⅱ的含9色流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)肺單細胞懸液以及支氣管肺灌洗液中嗜酸性粒細胞、DCs、中性粒細胞、淋巴細胞等細胞數(shù)，Batf3-/-小鼠哮喘模

9、型組比對照哮喘組顯著升高；肺組織切片HE/PAS染色，在呼吸道周圍炎癥細胞募集浸潤程度以及氣道粘液分泌程度方面，Batf3-/-小鼠哮喘模型組比對照哮喘組顯著減輕；ELISA方法檢測血清中IgG1的表達，發(fā)現(xiàn)Batf3-/-小鼠哮喘模型組比對照哮喘組顯著減輕，而這兩組IgG2b無差異；肺組織提取RNA做Realtime-PCR,發(fā)現(xiàn)Batf3-/-小鼠哮喘模型組比對照哮喘組在IL-4、IL-5基因水平上顯著降低。說明肺部CD103+DC

10、缺失后會導致肺部炎癥明顯下降，CD4+T增殖明顯降低。
　　CD11c-DTR轉基因嵌合小鼠哮喘模型，氣管內(nèi)注射DT可以清除肺部DC，我們的結果表明該處理方式清除CD103+DC的比例顯著高于CD11b+DC。CD11c-DTR轉基因嵌合小鼠霧化前一天氣管內(nèi)注射DT清除肺部DC，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)支氣管肺灌洗液以及肺部單細胞懸液的嗜酸性粒細胞、DCs、中性粒細胞、淋巴細胞等細胞數(shù)，在哮喘模型中氣管內(nèi)注射DT比PBS顯著下降；肺部切

11、片HE/PAS染色，在哮喘模型中氣管內(nèi)注射DT組比PBS組在呼吸道周圍炎癥細胞募集浸潤程度以及氣道粘液分泌程度上顯著減輕；ELISA方法檢測血清中IgG1的表達，發(fā)現(xiàn)在哮喘模型中氣管內(nèi)注射DT組比PBS組顯著減輕，而這兩組IgG2b無差異。從而證明說明在OVA再刺激階段，DT清除CD103+DC后會導致肺部炎癥明顯下降，CD4+T增殖明顯降低。
　　在體內(nèi)趨化實驗中，分選C57BL/6哮喘模型中和對照小鼠CD103+DC、CD11

12、b+DC、AM注射到小鼠后背氣泡中，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)嗜酸性細胞、T淋巴細胞顯著增加。用流式細胞儀分選C57BL/6小鼠CD103+DC、CD11b+DC氣管內(nèi)注射正常C57BL/6，48h流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)嗜酸性細胞、T淋巴細胞顯著增加。說明肺部DC亞群中CD103+DC直接趨化T淋巴細胞到達肺部，從而引起肺部TH2反應。
　　結論：
　　1、肺部CD103+DC在過敏性哮喘的肺部炎癥過程中有促進炎癥作用；
　　2、