ANP信號調控CD4+T細胞及其在過敏性哮喘中的作用研究.pdf

1、前言：
　　 支氣管哮喘（簡稱哮喘），是一種復雜的慢性氣道疾病，以持續(xù)的氣道炎癥和氣道高反應性為特點。在哮喘氣道炎癥中，多種細胞及細胞因子參與其中，如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞等。其中，CD4+T淋巴細胞家族被證實是哮喘免疫學發(fā)病機制的重要效應細胞，其各亞群均發(fā)育于同一前體細胞-Th0細胞（又稱初始CD4+T細胞），最經典的Th1/Th2細胞亞群數量與功能失衡即Th2型應答優(yōu)勢化早已被公認為過敏性哮喘的重要發(fā)

2、病機制。在過敏性哮喘中，被激活的Th2細胞產生大量的細胞因子如IL-4、IL-5等，而這些細胞因子在誘導氣道嗜酸性粒細胞炎癥中發(fā)揮主導作用。
　　 Th17細胞，是近年新發(fā)現的、不同于Th1/Th2細胞亞群的CD4+T細胞家族成員，在機體炎癥反應和免疫應答尤其是自身免疫方面發(fā)揮重要作用。在CD4+T細胞家族中，類似于Th1/IFN-γ和Th2/IL-4，IL-17為Th17細胞的身份標識因子，也是代表性的細胞因子。實驗發(fā)現Th1

3、7/IL-17也參與了過敏性哮喘的發(fā)病，但具體機制至今不完全清楚。
　　 ANP(atrialnatriureticpeptide)-心房利鈉肽，又名心鈉素，源于ANP激素原(pro-ANP)，最早從心房組織分離鑒定的多效能血管活性肽，因具有擴血管、利鈉、利尿等作用而聞名。其實，肺臟是除心血管系統外重要的ANP合成部位，同時也是ANP的靶器官之一。
　　 研究表明ANP廣泛存在于外周肺組織、氣管上皮細胞、呼吸上皮、人胎肺

4、組織等部位;通過放射核素定位和免疫細胞化學證實，肺部支氣管上皮和肺泡細胞均存在ANP的效應受體NPRA(natriureticpeptidereceptorA)及其清除受體NPRC(natriureticpeptidereceptorC);人、豬、鼠的肺部均表達NPRA及NPRC;而且與腎臟和肝臟組織勻漿相比較，肺組織勻漿能更大程度的通過中性肽鏈內切酶降解pro-ANP。上述ANP、高親和性ANP作用受體及大量降解ANP的酶的存在，表明

5、肺不僅僅是ANP的靶器官，它自身亦擁有著完善的ANP代謝系統，而不只是依賴于循環(huán)中的ANP。這暗示ANP信號可能在肺部生理、病理過程中有著不可忽視的作用。然而，迄今為止，關于ANP信號在肺部的生理病理學功能知之甚少。
　　 其實，ANP信號除了其經典的調節(jié)機體容量-壓力內穩(wěn)態(tài)作用外，越來越多的證據表明ANP信號在炎癥和免疫反應方面也可能發(fā)揮重要作用。如在豬、小鼠、大鼠的胸腺、脾臟、淋巴結里存在ANP激素原;在人、鳥、小鼠的胸腺和

6、扁桃體均能測出ANPmRNA;ANP信號可抑制胸腺細胞的增殖和分化;體外實驗發(fā)現ANP可以劑量依賴方式誘導腹腔肥大細胞釋放組胺;ANP信號還可影響中性粒細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞的功能活性等。此外，T淋巴細胞亦可表達ANP的作用受體NPRA。這些都說明了ANP信號確實與炎癥反應與免疫應答密切相關。
　　 有臨床觀察發(fā)現在哮喘患者急性發(fā)作期，外周血ANP水平較緩解期和正常人均有明顯的升高，這提示ANP信號可能與哮喘發(fā)病相關，但其在

7、哮喘發(fā)病中的具體效應及作用機制尚不明確?；谇笆觯覀兲岢黾僬f:既然哮喘患者外周血中ANP水平有明顯異常的變化，而且ANP信號也與免疫炎癥反應密切相關，那么ANP信號是否有可能通過調節(jié)CD4+T細胞的功能活性而參與過敏性哮喘的發(fā)病呢？
　　 本課題將以小鼠脾源性CD4+T細胞和過敏性哮喘小鼠模型作為研究對象進行觀察以期達到以下研究目的:一、研究ANP信號是否調控CD4+T細胞的功能活性及其可能的作用通路;二、觀察ANP信號是否通

8、過調控CD4+T細胞功能活性而參與過敏性哮喘的發(fā)病。首先，利用免疫磁珠分選法獲取純化的小鼠脾臟CD4+T細胞行體外研究，觀察ANP信號對CD4+T細胞分化及功能的調控作用;其次，利用小鼠成功建立過敏性哮喘模型，進行在體干預ANP信號后，觀察對哮喘小鼠模型氣道炎癥及CD4+T細胞相應轉錄因子及細胞因子等的影響，初步闡明ANP信號通過調控CD4+T細胞功能活性而參與過敏性哮喘的發(fā)病，也為認識ANP信號在其他肺部疾病的作用提供參考。
　

9、　 第一章ANP信號對Th17細胞分化和功能的作用研究
　　 目的：
　　 (1)體外觀察ANP信號對Th17細胞分化和功能的影響;
　　 (2)探討ANP調控Th17細胞的信號通路。
　　 方法：
　　 (1)無菌提取BALB/c小鼠脾臟，充分研磨制備單個核細胞懸液;
　　 (2)利用MACS技術獲取純化的CD4+T細胞，計數并測定細胞活力;
　　 (3)按原液組、定向分化未干

10、預組（簡稱分化組）、定向分化+ANP組（簡稱ANP組）、定向分化+A71915(ANP/NPRA信號抑制劑)+ANP組（簡稱A71915組）及定向分化+KT5823(NPRA受體偶聯PKG激酶的抑制劑)+ANP組（簡稱KT5823組）培養(yǎng)4天;
　　 (4)干預ANP信號后，檢測第二信使cGMP水平變化;定向分化培養(yǎng)4天后，流式檢測IL-17+-CD4+T細胞(Th17)數量、Western-Blot(WB)檢測各組中Th17細

11、胞轉錄因子水平（RORγt及BATF）及ELISA檢測培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-17的變化。
　　 結果：
　　 (1)相較于原液組，anti-IFN-γ抗體、anti-IL-4抗體、TGF-β1、IL-6及IL-23細胞因子組成的定向分化誘導微環(huán)境能明顯的誘導Th0細胞定向分化為Th17細胞，同時伴隨著細胞因子IL-17量的明顯增加(P＜0.01);
　　 (2)相較于定向分化組，加入ANP后可抑制Th17細胞

12、的分化數量且伴隨著Th17細胞特異性轉錄因子RORγt及BATF表達下降與培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-17含量的減少（P均＜0.05），并呈現濃度依賴性(10-8-10-6M)（P＜0.05）;
　　 (3)提前加入ANP/NPRA抑制劑-A71915(10-6M)后，ANP對Th17細胞分化和功能的抑制效應被明顯的阻斷（P均＜0.05）;
　　 (4)同樣，提前加入NPRA受體偶聯的PKG激酶抑制劑-KT5823同樣可抵

13、消ANP對Th17細胞分化和功能的影響（P均＜0.05）;
　　 (5)ANP信號的干預變化均導致與NPRA耦聯的第二信使cGMP水平的相應變化（P均＜0.01）。
　　 結論：
　　 (1)在體外，ANP信號可抑制Th17細胞的分化和功能，并呈濃度依賴性;
　　 (2)NPRA-PKG信號通路在ANP調控Th17細胞分化和功能的過程中發(fā)揮重要作用。
　　 第二章ANP信號對Th17/IL-17的

14、影響及其在過敏性哮喘小鼠模型的作用探討
　　 目的：
　　 (1)建立并評估OVA誘導的過敏性哮喘小鼠模型;
　　 (2)觀察ANP及其受體NPRA在過敏性哮喘小鼠模型中的變化;
　　 (3)觀察ANP信號對過敏性哮喘小鼠模型氣道炎癥及肺組織中Th17細胞特異性轉錄因子蛋白表達和肺局部IL-17水平的影響。
　　 方法：
　　 取40只SPF級BABL/c雌性小鼠，按在體實驗目的隨機分為五

15、組:正常組、哮喘未干預組（簡稱哮喘組）、ANP霧化吸入組（簡稱ANP組）、ANP霧化吸入+A71915腹腔注射組（簡稱ANP+A71915組）及A71915腹腔注射組（簡稱A71915組），每組8只。利用10μgOVA/只+0.2mlAl(OH)3/只腹腔注射致敏、5％OVA溶液霧化激發(fā)模擬建立過敏性哮喘模型，同時正常組則以等體積的PBS代替OVA行致敏、激發(fā);ANP組在每次霧化OVA溶液前30min給予ANP干粉溶液（濃度為1μg/g

16、小鼠）霧化吸入;ANP+A71915組則在每次霧化ANP干粉溶液前30min予以腹腔注射ANP信號的抑制劑-A71915（濃度0.5μg/g小鼠）;而A71915組即OVA霧化激發(fā)前30min腹腔注射A71915，其余操作同哮喘未干預組。致敏和霧化激發(fā)過程中注意觀察記錄小鼠的一般行為活動。完成最后一次激發(fā)24h后處理所有小鼠，實驗內容包括:(1)麻醉小鼠，通過氣管插管吸入不同濃度的乙酰甲膽堿溶液后，有創(chuàng)肺阻抗法測定各組小鼠的氣道反應性(

17、RL及Cdyn)變化;(2)利用支氣管肺泡灌洗法收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid-BALF)行細胞總數計數及分類計數，并檢測BALF上清液中ANP、IL-4及IL-17的含量;(3)肺組織病理學觀察分析;(4)Western-blot(WB)檢測正常與哮喘組小鼠肺組織和脾源性CD4+T細胞中ANP效應受體-NPRA的變化;(5)WB測定肺組織Th17細胞特異性轉錄因子RORγt/BATF表達水平

18、的變化及肺組織勻漿上清液ANP、IL-4及IL-17的含量。
　　 結果：
　　 (1)哮喘組及其他三個藥物干預組小鼠在霧化激發(fā)時均有不同程度的哮喘樣發(fā)作癥狀，如身體蜷縮、煩躁不安、撓耳抓鼻、呼吸急促、大小便失禁等表現，而正常組則表現基本正常，建模和在體干預過程中未出現小鼠死亡現象;
　　 (2)與正常組比較，哮喘組的肺阻力(RL)對不同濃度的乙酰甲膽堿(Mch)反應曲線明顯上移(P＜0.01);同時肺動態(tài)順應性

19、(Cdyn)則明顯下移(P＜0.01)，提示成功模擬過敏性哮喘的氣道高反應性;
　　 (3)相較于正常組，ANP+A71915及A71915組的肺功能檢測發(fā)現氣道高反應性仍存在（P均＜0.05），但較哮喘組有所緩解(P均＜0.05);而ANP組小鼠的肺阻力和肺動態(tài)順應性無顯著變化，接近于正常組水平（P均＞0.05）;
　　 (4)哮喘組的BALF中細胞總數及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等分類計數均明顯高于正常組（P均＜0.01

20、）;然而ANP組BALF中細胞總數計數及分類計數不僅明顯高于正常組（P均＜0.01），甚至還高于哮喘組（P均＜0.05）;A71915組則較哮喘組明顯減少(P＜0.05);而A71915+ANP組中細胞總數及嗜酸性粒細胞計數較ANP組減少（P均＜0.05）;
　　 (5)相較于正常組，哮喘組BALF上清液中IL-4水平明顯升高(P＜0.01)，IL-17含量亦增加(P＜0.01);ANP組BALF中IL-4水平升高更顯著(P＜0

21、.01)，甚至高于哮喘組(P＜0.05)，但未見IL-17水平的明顯下降(P＞0.05);在A71915組，IL-4、IL-17水平相比于哮喘組均下降（P均＜0.05）;A71915+ANP組較ANP組IL-4有所下降(P＜0.05)但IL-17變化亦不顯著(P＞0.05);
　　 (6)與正常組比較，哮喘組小鼠BALF及肺組織勻漿上清液中ANP的含量均升高（P均＜0.01）;
　　 (7)哮喘組小鼠肺組織中ANP作用受

22、體NPRA表達水平較正常組明顯升高(P＜0.05);而且，哮喘小鼠脾源性CD4+T細胞中NPRA的表達亦高于正常小鼠(P＜0.05);
　　 (8)與正常組相比，哮喘組支氣管-肺組織病理學檢測發(fā)現支氣管及血管周圍分布著大量的炎癥細胞（炎癥評分，P＜0.01），并且PAS染色可見氣道上皮周圍有許多的粘液分泌（粘液評分，P＜0.01）。而吸入ANP后，支氣管及血管周圍的炎性細胞浸潤及粘液分泌程度比哮喘組更嚴重(P＜0.05);ANP

23、+A71915組較ANP組均有所緩解（P均＜0.05）;A71915組則較哮喘組明顯改善（P均＜0.01）;
　　 (9)與正常組比較，哮喘組小鼠肺組織中Th17細胞轉錄因子RORγt及BATF均表達升高（P均＜0.05）;吸入ANP后肺組織中RORγt及BATF的表達則較哮喘組有所下降（P均＜0.05）;而阻斷ANP信號即使用A71915后，RORγt的表達情況有所逆轉(P＜0.05)但BATF的表達差異無統計學差異(P＞0.

24、05);
　　 (10)各組肺組織勻漿上清液中IL-4、IL-17水平的變化趨勢則與BALF中的測定結果基本一致。
　　 結論
　　 (1)過敏性哮喘小鼠模型建立成功;
　　 (2)ANP信號參與了過敏性哮喘的發(fā)病;
　　 (3)ANP信號可緩解過敏性哮喘的氣道高反應性;
　　 (4)ANP信號雖可下調肺局部Th17細胞RORγt及BATF轉錄因子的表達，但IL-17水平變化不明顯;雖與體

25、外觀察結果不完全一致，但仍可能是ANP信號加劇過敏性哮喘氣道炎癥的機制之一;
　　 (5)ANP信號加重過敏性哮喘氣道炎癥反應。
　　 第三章ANP信號對Th1/Th2細胞功能平衡的影響及其在過敏性哮喘氣道炎癥中的作用探討
　　 目的：
　　 (1)體外觀察ANP信號對Th1/Th2細胞功能平衡的影響;
　　 (2)結合在體實驗，初步探討ANP信號通過促進Th2細胞功能優(yōu)勢化而加重過敏性哮喘氣道炎

26、癥。
　　 方法：
　　 無菌提取哮喘小鼠脾臟并研磨分離制備單個核細胞懸液后，利用免疫磁珠陽性分選獲取脾源性CD4+T細胞行體外干預實驗。計數、測定活力后按一定比例接種培養(yǎng)。依不同的試劑干預分為原液組、ANP組、ANP+A71915組。加入ConA（終濃度為5μg/ml）刺激培養(yǎng)24小時后收集細胞。Western-Blot法檢測T-bet/GATA3蛋白的表達變化，ELISA法測定培養(yǎng)上清液中IFN-γ/IL-4因子含量

27、以評估ANP信號對Th1/Th2細胞功能平衡的影響。
　　 在體實驗方面，各組小鼠接受最后一次激發(fā)結束24h后取肺組織，測定其中Th1/Th2細胞特異性轉錄因子T-bet/GATA3蛋白表達有無變化及BALF與肺組織勻漿上清液中IFN-γ水平的含量變化測定，在體實驗操作均與第二章實驗同步開展。
　　 結果：
　　 (1)相較于正常組，哮喘組小鼠肺組織中GATA3表達明顯增高(P＜0.05);而且相較于哮喘組，AN

28、P吸入組小鼠肺組織中GATA3蛋白表達更明顯(P＜0.05)，相反T-bet表達則下降(P＜0.05);阻斷ANP信號(A71915)后，轉錄因子GATA3表達有所下降(P＜0.05)，而T-bet的表達則有所恢復（P＜0.05）;
　　 (2)與哮喘組比較，ANP組肺組織勻漿上清液中與T-bet表達變化基本一致(P＜0.05)，但BALF中IFN-γ水平變化不明顯(P＞0.05);在A71915+ANP組中變化也不顯著(P＞0

29、.05);
　　 (3)在體外干預哮喘小鼠脾源性CD4+T細胞實驗中，加入ANP刺激后，相較于原液組，GATA3蛋白表達亦增加(P＜0.05)，同時伴隨T-bet的表達下降(P＜0.05)，變化趨勢基本同在體肺組織中的觀察結果;而提前加入ANP信號抑制劑A71915后，GATA3/T-bet的變化趨勢則被逆轉(P＜0.05);
　　 (4)相比較于原液組，ANP組細胞培養(yǎng)上清液中IL-4水平升高(P＜0.05)，而IFN