ANP信號調(diào)控CD4+T細(xì)胞及其在過敏性哮喘中的作用研究.pdf

1、前言：
　　 支氣管哮喘（簡稱哮喘），是一種復(fù)雜的慢性氣道疾病，以持續(xù)的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特點(diǎn)。在哮喘氣道炎癥中，多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與其中，如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。其中，CD4+T淋巴細(xì)胞家族被證實(shí)是哮喘免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的重要效應(yīng)細(xì)胞，其各亞群均發(fā)育于同一前體細(xì)胞-Th0細(xì)胞（又稱初始CD4+T細(xì)胞），最經(jīng)典的Th1/Th2細(xì)胞亞群數(shù)量與功能失衡即Th2型應(yīng)答優(yōu)勢化早已被公認(rèn)為過敏性哮喘的重要發(fā)

2、病機(jī)制。在過敏性哮喘中，被激活的Th2細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子如IL-4、IL-5等，而這些細(xì)胞因子在誘導(dǎo)氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥中發(fā)揮主導(dǎo)作用。
　　 Th17細(xì)胞，是近年新發(fā)現(xiàn)的、不同于Th1/Th2細(xì)胞亞群的CD4+T細(xì)胞家族成員，在機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答尤其是自身免疫方面發(fā)揮重要作用。在CD4+T細(xì)胞家族中，類似于Th1/IFN-γ和Th2/IL-4，IL-17為Th17細(xì)胞的身份標(biāo)識因子，也是代表性的細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Th1

3、7/IL-17也參與了過敏性哮喘的發(fā)病，但具體機(jī)制至今不完全清楚。
　　 ANP(atrialnatriureticpeptide)-心房利鈉肽，又名心鈉素，源于ANP激素原(pro-ANP)，最早從心房組織分離鑒定的多效能血管活性肽，因具有擴(kuò)血管、利鈉、利尿等作用而聞名。其實(shí)，肺臟是除心血管系統(tǒng)外重要的ANP合成部位，同時(shí)也是ANP的靶器官之一。
　　 研究表明ANP廣泛存在于外周肺組織、氣管上皮細(xì)胞、呼吸上皮、人胎肺

4、組織等部位;通過放射核素定位和免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)，肺部支氣管上皮和肺泡細(xì)胞均存在ANP的效應(yīng)受體NPRA(natriureticpeptidereceptorA)及其清除受體NPRC(natriureticpeptidereceptorC);人、豬、鼠的肺部均表達(dá)NPRA及NPRC;而且與腎臟和肝臟組織勻漿相比較，肺組織勻漿能更大程度的通過中性肽鏈內(nèi)切酶降解pro-ANP。上述ANP、高親和性ANP作用受體及大量降解ANP的酶的存在，表明

5、肺不僅僅是ANP的靶器官，它自身亦擁有著完善的ANP代謝系統(tǒng)，而不只是依賴于循環(huán)中的ANP。這暗示ANP信號可能在肺部生理、病理過程中有著不可忽視的作用。然而，迄今為止，關(guān)于ANP信號在肺部的生理病理學(xué)功能知之甚少。
　　 其實(shí)，ANP信號除了其經(jīng)典的調(diào)節(jié)機(jī)體容量-壓力內(nèi)穩(wěn)態(tài)作用外，越來越多的證據(jù)表明ANP信號在炎癥和免疫反應(yīng)方面也可能發(fā)揮重要作用。如在豬、小鼠、大鼠的胸腺、脾臟、淋巴結(jié)里存在ANP激素原;在人、鳥、小鼠的胸腺和

6、扁桃體均能測出ANPmRNA;ANP信號可抑制胸腺細(xì)胞的增殖和分化;體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ANP可以劑量依賴方式誘導(dǎo)腹腔肥大細(xì)胞釋放組胺;ANP信號還可影響中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的功能活性等。此外，T淋巴細(xì)胞亦可表達(dá)ANP的作用受體NPRA。這些都說明了ANP信號確實(shí)與炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答密切相關(guān)。
　　 有臨床觀察發(fā)現(xiàn)在哮喘患者急性發(fā)作期，外周血ANP水平較緩解期和正常人均有明顯的升高，這提示ANP信號可能與哮喘發(fā)病相關(guān)，但其在

7、哮喘發(fā)病中的具體效應(yīng)及作用機(jī)制尚不明確?；谇笆觯覀兲岢黾僬f:既然哮喘患者外周血中ANP水平有明顯異常的變化，而且ANP信號也與免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，那么ANP信號是否有可能通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的功能活性而參與過敏性哮喘的發(fā)病呢？
　　 本課題將以小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞和過敏性哮喘小鼠模型作為研究對象進(jìn)行觀察以期達(dá)到以下研究目的:一、研究ANP信號是否調(diào)控CD4+T細(xì)胞的功能活性及其可能的作用通路;二、觀察ANP信號是否通

8、過調(diào)控CD4+T細(xì)胞功能活性而參與過敏性哮喘的發(fā)病。首先，利用免疫磁珠分選法獲取純化的小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞行體外研究，觀察ANP信號對CD4+T細(xì)胞分化及功能的調(diào)控作用;其次，利用小鼠成功建立過敏性哮喘模型，進(jìn)行在體干預(yù)ANP信號后，觀察對哮喘小鼠模型氣道炎癥及CD4+T細(xì)胞相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子等的影響，初步闡明ANP信號通過調(diào)控CD4+T細(xì)胞功能活性而參與過敏性哮喘的發(fā)病，也為認(rèn)識ANP信號在其他肺部疾病的作用提供參考。
　

9、　 第一章ANP信號對Th17細(xì)胞分化和功能的作用研究
　　 目的：
　　 (1)體外觀察ANP信號對Th17細(xì)胞分化和功能的影響;
　　 (2)探討ANP調(diào)控Th17細(xì)胞的信號通路。
　　 方法：
　　 (1)無菌提取BALB/c小鼠脾臟，充分研磨制備單個(gè)核細(xì)胞懸液;
　　 (2)利用MACS技術(shù)獲取純化的CD4+T細(xì)胞，計(jì)數(shù)并測定細(xì)胞活力;
　　 (3)按原液組、定向分化未干

10、預(yù)組（簡稱分化組）、定向分化+ANP組（簡稱ANP組）、定向分化+A71915(ANP/NPRA信號抑制劑)+ANP組（簡稱A71915組）及定向分化+KT5823(NPRA受體偶聯(lián)PKG激酶的抑制劑)+ANP組（簡稱KT5823組）培養(yǎng)4天;
　　 (4)干預(yù)ANP信號后，檢測第二信使cGMP水平變化;定向分化培養(yǎng)4天后，流式檢測IL-17+-CD4+T細(xì)胞(Th17)數(shù)量、Western-Blot(WB)檢測各組中Th17細(xì)

11、胞轉(zhuǎn)錄因子水平（RORγt及BATF）及ELISA檢測培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-17的變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)相較于原液組，anti-IFN-γ抗體、anti-IL-4抗體、TGF-β1、IL-6及IL-23細(xì)胞因子組成的定向分化誘導(dǎo)微環(huán)境能明顯的誘導(dǎo)Th0細(xì)胞定向分化為Th17細(xì)胞，同時(shí)伴隨著細(xì)胞因子IL-17量的明顯增加(P＜0.01);
　　 (2)相較于定向分化組，加入ANP后可抑制Th17細(xì)胞

12、的分化數(shù)量且伴隨著Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt及BATF表達(dá)下降與培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-17含量的減少（P均＜0.05），并呈現(xiàn)濃度依賴性(10-8-10-6M)（P＜0.05）;
　　 (3)提前加入ANP/NPRA抑制劑-A71915(10-6M)后，ANP對Th17細(xì)胞分化和功能的抑制效應(yīng)被明顯的阻斷（P均＜0.05）;
　　 (4)同樣，提前加入NPRA受體偶聯(lián)的PKG激酶抑制劑-KT5823同樣可抵

13、消ANP對Th17細(xì)胞分化和功能的影響（P均＜0.05）;
　　 (5)ANP信號的干預(yù)變化均導(dǎo)致與NPRA耦聯(lián)的第二信使cGMP水平的相應(yīng)變化（P均＜0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 (1)在體外，ANP信號可抑制Th17細(xì)胞的分化和功能，并呈濃度依賴性;
　　 (2)NPRA-PKG信號通路在ANP調(diào)控Th17細(xì)胞分化和功能的過程中發(fā)揮重要作用。
　　 第二章ANP信號對Th17/IL-17的

14、影響及其在過敏性哮喘小鼠模型的作用探討
　　 目的：
　　 (1)建立并評估OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘小鼠模型;
　　 (2)觀察ANP及其受體NPRA在過敏性哮喘小鼠模型中的變化;
　　 (3)觀察ANP信號對過敏性哮喘小鼠模型氣道炎癥及肺組織中Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)和肺局部IL-17水平的影響。
　　 方法：
　　 取40只SPF級BABL/c雌性小鼠，按在體實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾S機(jī)分為五

15、組:正常組、哮喘未干預(yù)組（簡稱哮喘組）、ANP霧化吸入組（簡稱ANP組）、ANP霧化吸入+A71915腹腔注射組（簡稱ANP+A71915組）及A71915腹腔注射組（簡稱A71915組），每組8只。利用10μgOVA/只+0.2mlAl(OH)3/只腹腔注射致敏、5％OVA溶液霧化激發(fā)模擬建立過敏性哮喘模型，同時(shí)正常組則以等體積的PBS代替OVA行致敏、激發(fā);ANP組在每次霧化OVA溶液前30min給予ANP干粉溶液（濃度為1μg/g

16、小鼠）霧化吸入;ANP+A71915組則在每次霧化ANP干粉溶液前30min予以腹腔注射ANP信號的抑制劑-A71915（濃度0.5μg/g小鼠）;而A71915組即OVA霧化激發(fā)前30min腹腔注射A71915，其余操作同哮喘未干預(yù)組。致敏和霧化激發(fā)過程中注意觀察記錄小鼠的一般行為活動。完成最后一次激發(fā)24h后處理所有小鼠，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括:(1)麻醉小鼠，通過氣管插管吸入不同濃度的乙酰甲膽堿溶液后，有創(chuàng)肺阻抗法測定各組小鼠的氣道反應(yīng)性(

17、RL及Cdyn)變化;(2)利用支氣管肺泡灌洗法收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid-BALF)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)，并檢測BALF上清液中ANP、IL-4及IL-17的含量;(3)肺組織病理學(xué)觀察分析;(4)Western-blot(WB)檢測正常與哮喘組小鼠肺組織和脾源性CD4+T細(xì)胞中ANP效應(yīng)受體-NPRA的變化;(5)WB測定肺組織Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt/BATF表達(dá)水平

18、的變化及肺組織勻漿上清液ANP、IL-4及IL-17的含量。
　　 結(jié)果：
　　 (1)哮喘組及其他三個(gè)藥物干預(yù)組小鼠在霧化激發(fā)時(shí)均有不同程度的哮喘樣發(fā)作癥狀，如身體蜷縮、煩躁不安、撓耳抓鼻、呼吸急促、大小便失禁等表現(xiàn)，而正常組則表現(xiàn)基本正常，建模和在體干預(yù)過程中未出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象;
　　 (2)與正常組比較，哮喘組的肺阻力(RL)對不同濃度的乙酰甲膽堿(Mch)反應(yīng)曲線明顯上移(P＜0.01);同時(shí)肺動態(tài)順應(yīng)性

19、(Cdyn)則明顯下移(P＜0.01)，提示成功模擬過敏性哮喘的氣道高反應(yīng)性;
　　 (3)相較于正常組，ANP+A71915及A71915組的肺功能檢測發(fā)現(xiàn)氣道高反應(yīng)性仍存在（P均＜0.05），但較哮喘組有所緩解(P均＜0.05);而ANP組小鼠的肺阻力和肺動態(tài)順應(yīng)性無顯著變化，接近于正常組水平（P均＞0.05）;
　　 (4)哮喘組的BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等分類計(jì)數(shù)均明顯高于正常組（P均＜0.01

20、）;然而ANP組BALF中細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)不僅明顯高于正常組（P均＜0.01），甚至還高于哮喘組（P均＜0.05）;A71915組則較哮喘組明顯減少(P＜0.05);而A71915+ANP組中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較ANP組減少（P均＜0.05）;
　　 (5)相較于正常組，哮喘組BALF上清液中IL-4水平明顯升高(P＜0.01)，IL-17含量亦增加(P＜0.01);ANP組BALF中IL-4水平升高更顯著(P＜0

21、.01)，甚至高于哮喘組(P＜0.05)，但未見IL-17水平的明顯下降(P＞0.05);在A71915組，IL-4、IL-17水平相比于哮喘組均下降（P均＜0.05）;A71915+ANP組較ANP組IL-4有所下降(P＜0.05)但I(xiàn)L-17變化亦不顯著(P＞0.05);
　　 (6)與正常組比較，哮喘組小鼠BALF及肺組織勻漿上清液中ANP的含量均升高（P均＜0.01）;
　　 (7)哮喘組小鼠肺組織中ANP作用受

22、體NPRA表達(dá)水平較正常組明顯升高(P＜0.05);而且，哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中NPRA的表達(dá)亦高于正常小鼠(P＜0.05);
　　 (8)與正常組相比，哮喘組支氣管-肺組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)支氣管及血管周圍分布著大量的炎癥細(xì)胞（炎癥評分，P＜0.01），并且PAS染色可見氣道上皮周圍有許多的粘液分泌（粘液評分，P＜0.01）。而吸入ANP后，支氣管及血管周圍的炎性細(xì)胞浸潤及粘液分泌程度比哮喘組更嚴(yán)重(P＜0.05);ANP

23、+A71915組較ANP組均有所緩解（P均＜0.05）;A71915組則較哮喘組明顯改善（P均＜0.01）;
　　 (9)與正常組比較，哮喘組小鼠肺組織中Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt及BATF均表達(dá)升高（P均＜0.05）;吸入ANP后肺組織中RORγt及BATF的表達(dá)則較哮喘組有所下降（P均＜0.05）;而阻斷ANP信號即使用A71915后，RORγt的表達(dá)情況有所逆轉(zhuǎn)(P＜0.05)但BATF的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.

24、05);
　　 (10)各組肺組織勻漿上清液中IL-4、IL-17水平的變化趨勢則與BALF中的測定結(jié)果基本一致。
　　 結(jié)論
　　 (1)過敏性哮喘小鼠模型建立成功;
　　 (2)ANP信號參與了過敏性哮喘的發(fā)病;
　　 (3)ANP信號可緩解過敏性哮喘的氣道高反應(yīng)性;
　　 (4)ANP信號雖可下調(diào)肺局部Th17細(xì)胞RORγt及BATF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，但I(xiàn)L-17水平變化不明顯;雖與體

25、外觀察結(jié)果不完全一致，但仍可能是ANP信號加劇過敏性哮喘氣道炎癥的機(jī)制之一;
　　 (5)ANP信號加重過敏性哮喘氣道炎癥反應(yīng)。
　　 第三章ANP信號對Th1/Th2細(xì)胞功能平衡的影響及其在過敏性哮喘氣道炎癥中的作用探討
　　 目的：
　　 (1)體外觀察ANP信號對Th1/Th2細(xì)胞功能平衡的影響;
　　 (2)結(jié)合在體實(shí)驗(yàn)，初步探討ANP信號通過促進(jìn)Th2細(xì)胞功能優(yōu)勢化而加重過敏性哮喘氣道炎

26、癥。
　　 方法：
　　 無菌提取哮喘小鼠脾臟并研磨分離制備單個(gè)核細(xì)胞懸液后，利用免疫磁珠陽性分選獲取脾源性CD4+T細(xì)胞行體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)。計(jì)數(shù)、測定活力后按一定比例接種培養(yǎng)。依不同的試劑干預(yù)分為原液組、ANP組、ANP+A71915組。加入ConA（終濃度為5μg/ml）刺激培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞。Western-Blot法檢測T-bet/GATA3蛋白的表達(dá)變化，ELISA法測定培養(yǎng)上清液中IFN-γ/IL-4因子含量

27、以評估ANP信號對Th1/Th2細(xì)胞功能平衡的影響。
　　 在體實(shí)驗(yàn)方面，各組小鼠接受最后一次激發(fā)結(jié)束24h后取肺組織，測定其中Th1/Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA3蛋白表達(dá)有無變化及BALF與肺組織勻漿上清液中IFN-γ水平的含量變化測定，在體實(shí)驗(yàn)操作均與第二章實(shí)驗(yàn)同步開展。
　　 結(jié)果：
　　 (1)相較于正常組，哮喘組小鼠肺組織中GATA3表達(dá)明顯增高(P＜0.05);而且相較于哮喘組，AN

28、P吸入組小鼠肺組織中GATA3蛋白表達(dá)更明顯(P＜0.05)，相反T-bet表達(dá)則下降(P＜0.05);阻斷ANP信號(A71915)后，轉(zhuǎn)錄因子GATA3表達(dá)有所下降(P＜0.05)，而T-bet的表達(dá)則有所恢復(fù)（P＜0.05）;
　　 (2)與哮喘組比較，ANP組肺組織勻漿上清液中與T-bet表達(dá)變化基本一致(P＜0.05)，但BALF中IFN-γ水平變化不明顯(P＞0.05);在A71915+ANP組中變化也不顯著(P＞0

29、.05);
　　 (3)在體外干預(yù)哮喘小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，加入ANP刺激后，相較于原液組，GATA3蛋白表達(dá)亦增加(P＜0.05)，同時(shí)伴隨T-bet的表達(dá)下降(P＜0.05)，變化趨勢基本同在體肺組織中的觀察結(jié)果;而提前加入ANP信號抑制劑A71915后，GATA3/T-bet的變化趨勢則被逆轉(zhuǎn)(P＜0.05);
　　 (4)相比較于原液組，ANP組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4水平升高(P＜0.05)，而IFN