CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的IL-10、IL-35在過(guò)敏性哮喘中作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景和目的:
　　哮喘是一種由多種因素引起的氣道炎癥性疾病，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制研究也取得了很大進(jìn)展。據(jù)研究顯示有多種免疫細(xì)胞、免疫分子等介質(zhì)參與哮喘疾病的調(diào)節(jié)，這主要是因?yàn)橄颊邭獾捞幱诟叻磻?yīng)性狀態(tài)，而且這種狀態(tài)持續(xù)發(fā)生。早期人們傳統(tǒng)認(rèn)為 Th1/Th2失衡和IgE介導(dǎo)的變應(yīng)原性致敏是導(dǎo)致哮喘的根本原因。大量醫(yī)務(wù)科研工作者從免疫學(xué)角度對(duì)哮喘的機(jī)制進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞分泌的IL-10、

2、IL-35與哮喘的發(fā)生有關(guān)，但具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。
　　CD4+CD25+Treg是最新發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中不可缺少的角色，主要靠分泌相關(guān)抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制功能。Treg(CD4＋CD25＋T)與Teff（CD4＋CD25-T)細(xì)胞在可溶性抗CD3抗體、抗CD28抗體聯(lián)合作用下并相互親密接觸，才能使Treg細(xì)胞分泌相關(guān)抑制性因子。研究顯示，Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能的細(xì)胞因子主要

3、有IL-10、IL-35和TGF-β。Treg細(xì)胞分泌的IL-10是免疫抑制功能的重要成分，是與Treg密切相關(guān)發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞因子，但不是唯一的抑制性細(xì)胞因子。IL-35是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)Treg細(xì)胞免疫抑制功能的重要因子，它是IL-12家族的成員，由EBI3/IL-27β和IL12α/p35異源二聚體組成。它可以直接作用于效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮作用，能誘導(dǎo)初始 T細(xì)胞產(chǎn)生新型的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞-T35細(xì)胞（ iTR35)。有研究顯示，T

4、reg和Teff在體外共同培養(yǎng)后，能上調(diào)EBI3和IL12αmRNA的表達(dá)量。這表明Teff和Treg共同培養(yǎng)下可能增強(qiáng)IL-35的分泌，猜測(cè)Teff與Treg混合培養(yǎng)可能增強(qiáng)Treg的免疫調(diào)節(jié)功能。TGF-β也是介導(dǎo)Treg細(xì)胞非常重要的免疫抑制性因子。這些免疫抑制性因子也可能是在過(guò)敏性哮喘中發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的重要介質(zhì)。
　　方法：
　　1.將SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，分別用OVA和生理鹽水致敏

5、和激發(fā)，建立哮喘模型和對(duì)照模型。
　　2.解剖小鼠取出脾臟并充分研磨，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞。利用MACS(Magnetic Activated Cell Sorting)技術(shù)將脾臟單個(gè)核細(xì)胞分為T(mén)reg和Teff。3.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析所得的Treg和Teff的純度。
　　4. anti-CD3e包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，添加磁珠分選Treg和Teff細(xì)胞并加入
　　anti-CD28，在不同條件下，對(duì)Treg

6、和Teff進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，每種培養(yǎng)方式重復(fù)三個(gè)孔。
　　5.在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集上清用ELISA試劑盒檢測(cè)不同培養(yǎng)方式下IL-10、IL-35的蛋白表達(dá)量。收集不同培養(yǎng)方式下所得細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板，用熒光定量PCR檢測(cè)IL-10、EBI3和p35基因的mRNA表達(dá)情況。
　　6.應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析；利用GraphPad Pris

7、m5制作統(tǒng)計(jì)圖。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立小鼠哮喘模型和對(duì)照模型。
　　2.成功提取各個(gè)小鼠的單個(gè)核細(xì)胞并利用 MACS技術(shù)成功分選出 Treg(CD4＋CD25＋T)與 Teff（CD4＋CD25-T)細(xì)胞，分選出的 Treg和 Teff原代細(xì)胞純度達(dá)80％左右。
　　3.與對(duì)照組相比，六種培養(yǎng)方式IL-10、EBI3和P35的基因的相對(duì)表達(dá)量都有所下降，但無(wú)顯著性差異（0.5＜2-ΔΔCt＜2）。Treg

8、+Teff組和Treg+Teff+αCD3/CD28組的 IL-10、EBI3和 P35的基因表達(dá)量比其它四組明顯下降，其中Treg+Teff+αCD3/CD28組的IL-10下降顯著(2-ΔΔCt＜0.5）。
　　4.與對(duì)照組相比，不同培養(yǎng)方式的IL-10和IL-35的蛋白相對(duì)表達(dá)量都有下降，但無(wú)顯著性差異（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　Treg細(xì)胞分泌的 IL-10和 IL-35可能和過(guò)敏性哮喘有著密切的關(guān)系，