A型流感病毒NS1蛋白誘導細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、NS1(non-structuralprotein1)是一種與流感病毒毒力密切相關的多功能蛋白質(zhì)，它通過與宿主細胞多種組分相互作用，發(fā)揮復雜的生物學效應。不同毒株NS1蛋白的氨基酸序列存在差異，這造成不同毒株NS1蛋白引起的細胞凋亡效應以及其在細胞中的定位也不盡相同，從而對流感病毒的致病力產(chǎn)生一定的影響，但確切的分子機制并不清楚。本研究以人季節(jié)性流感病毒H3N2亞型和新型禽流感病毒H7N9亞型的NS1蛋白為研究對象，分別解析了H3N2/

2、NS1蛋白和H7N9/NS1蛋白誘導細胞凋亡的分子機制，同時揭示不同毒株NS1蛋白在細胞中的定位情況。
　　在本研究中，我們首先克隆不同毒株NS1蛋白的表達載體并轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，對表達NS1蛋白的細胞中caspase3/7的活性和PARP(poly ADP-ribose polymerase)的剪切進行檢測，結果顯示，H3N2/NS1能夠誘導激活caspase3/7，并剪切PARP。生物信息學分析H3N2/NS1蛋白C末端

3、含有一個核仁定位信號（nucleolar localization signal，NoLS）。免疫熒光與免疫沉淀結果表明 H3N2/NS1能靶向細胞核仁并與核仁素（nucleolin，NCL）相互作用。熒光定量PCR（Real-time PCR）和Western blot檢測H3N2/NS1蛋白表達的細胞中pre-45S rRNA的合成以及p53蛋白的表達水平，結果顯示與mock相比，H3N2/NS1蛋白表達的細胞中rRNA的合成減少至

4、20~30％，p53蛋白顯著積累。進一步的染色質(zhì)免疫沉淀結果顯示H3N2/NS1表達的細胞中，NCL與rRNA啟動子區(qū)上游控制元件（upstream control element，UCE）的結合顯著減少，同時RNA聚合酶I大亞單位RPA194與UCE的相互作用也明顯受到影響。對基因組DNA亞硫酸鹽處理后的甲基化特異PCR結果顯示，與mock細胞相比，H3N2/NS1表達的細胞UCE高甲基化（95.5% vs25.7%）。對NCL進行s

5、iRNA干擾，結果顯示在NCL合成受到抑制的情況下，pre-45S rRNA的合成顯著下降、p53蛋白明顯積累、UCE甲基化程度顯著上調(diào)，并且對NCL的干擾效果越好，細胞中pre-45S rRNA下降、p53蛋白增加以及UCE甲基化程度越明顯。免疫共沉淀的結果顯示，核糖體蛋白RPL5、RPL11、RPL23以及RLPS7均能夠與MDM2相互作用。通過這一系列的實驗結果，我們提出H3N2/NS1蛋白誘導HEK293T細胞凋亡的新機制：NS

6、1蛋白C末端的NoLS使NS1蛋白靶向細胞核仁并與NCL結合，二者的結合使得rRNA啟動子UCE高甲基化，進而使UCE與NCL的結合受阻，同時影響RNA聚合酶I與UCE的結合，進而使RNA聚合酶I介導的rRNA轉(zhuǎn)錄受到抑制，引發(fā)細胞的核仁應激，rRNA與核糖體蛋白（Ribosomal proteins，RPs）裝配受到干擾，游離的RPs從核仁中釋放出去并綁定MDM2，從而抑制p53的泛素化降解，引起細胞中p53的積累，從而激活caspa

7、se3/7，剪切PARP引起細胞凋亡。
　　另外，我們轉(zhuǎn)染H7N9/NS1表達質(zhì)粒進A549細胞，通過檢測caspase3/7活性以及PARP的剪切，明確H7N9/NS1能夠誘導A549細胞凋亡，qPCR以及Western blot檢測Bad和BAK的表達以及Cleaved-Caspase-7，結果顯示H7N9/NS1表達的細胞中BAK1和Bad的水平顯著增加，caspase-7表達上調(diào)。qPCR和Western blot檢測H7

8、N9/NS1轉(zhuǎn)染不同時間p53的mRNA和蛋白的表達變化，結果顯示H7N9/NS1轉(zhuǎn)染18和24 h后，細胞中p53的表達量分別提高1.5～1.8倍，而mRNA的水平并無顯著變化。我們對p53的ser15、ser20、ser37以及ser46位的磷酸化水平進行檢測，結果表明p53在ser37和ser46的磷酸化水平升高，分別為2.89倍和3.05倍，而在ser15和ser20沒有發(fā)生明顯的磷酸化。這些結果顯示，H7N9/NS1的表達能夠

9、使p53發(fā)生ser37和ser46位點的磷酸化，進而增加p53的穩(wěn)定性，激活caspase3和caspase7并剪切PARP，從而誘導細胞凋亡。
　　此外，我們構建了H1N1/NS1，H3N2/NS1，H5N1/NS1，H7N9/NS1的GFP融合表達質(zhì)粒，通過瞬時轉(zhuǎn)染和細胞質(zhì)核分離實驗，研究不同毒株NS1蛋白在8株不同細胞中的亞細胞定位。結果顯示，4種不同毒株NS1在所有8株細胞核中的分布都占主導地位，除此之外的分布又各有特點：

10、H1N1/NS1與H7N9/NS1都呈現(xiàn)典型的細胞質(zhì)分布；H3N2/NS1和H5N1/NS1在細胞質(zhì)中的定位不明顯；H3N2/NS1在核質(zhì)均勻分布并在核仁處聚積，而H5N1/NS1僅分布在細胞核質(zhì)中。同時各NS1蛋白在Vero細胞質(zhì)中分布均不明顯，而在COS-7細胞中所有4種NS1蛋白均呈現(xiàn)一致的細胞質(zhì)與細胞核分布，在細胞核仁中均不可見，包括H3N2/NS1蛋白。NS1蛋白亞細胞定位具有毒株和細胞特異性。
　　綜上，本研究分別解析