流感病毒NS1蛋白對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控及與Nucleolin相互作用的研究.pdf

1、甲型流感病毒屬于正黏病毒科，基因組由8股負(fù)鏈的RNA組成，其中第8節(jié)段RNA編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，該蛋白在受感染的宿主細(xì)胞中合成，在調(diào)控病毒致病性和毒力，影響宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)及凋亡等多個(gè)方面具有重要作用。
　　 本研究利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)2009年甲型流感NS1(2009NS1)和1918年流感NS1(1918NS1)蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，2009NS1蛋白與1918NS1蛋白相比較，在C端缺失了RKMARTIKSE10個(gè)

2、氨基酸，即PL結(jié)構(gòu)域。其余位點(diǎn)共發(fā)生了32個(gè)氨基酸變異。
　　 為進(jìn)一步研究甲型流感病毒NS1蛋白對(duì)真核細(xì)胞的作用，本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆了2009NS1基因、全基因合成獲得了1918NS1，應(yīng)用pNTAP-B、pCMV-HA、pEGFP-C1載體，構(gòu)建了TAPNS12009、HANS12009、HANS11918等5種NS1真核表達(dá)載體。利用脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，應(yīng)用Western Blot方法，檢測(cè)NS

3、1蛋白表達(dá)量，通過對(duì)轉(zhuǎn)染試劑體積、質(zhì)粒質(zhì)量等優(yōu)化，獲得高效轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞條件為：脂質(zhì)體20009μL，質(zhì)粒2μg，瞬轉(zhuǎn)NS196h后，NS1蛋白的表達(dá)量達(dá)最高值。
　　 應(yīng)用2009NS1、1918NS1真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，利用顯微鏡觀察表達(dá)NS1蛋白的A549細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，體積變小，變圓，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊緣化等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。應(yīng)用AnnexinV染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于空白和陰性對(duì)

4、照組，且A549/1918NS1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于A549/2009 NS1；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，且A549/1918NS1 G2/M期與Apoptotic期的細(xì)胞比例均大于A549/2009NS1；利用Western Blot方法檢測(cè)NS1蛋白對(duì)細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)NS1蛋白可上調(diào)p53、p21蛋白的表達(dá)，同時(shí)能促進(jìn)p53蛋白15位Ser的磷酸化，且1918NS1蛋白對(duì)這些蛋白的作用

5、大于2009NS1蛋白。結(jié)合以上結(jié)果推測(cè)NS1蛋白能夠通過上調(diào)p53、p21蛋白表達(dá)、促進(jìn)p53磷酸化，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，同時(shí)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，1918NS1作用強(qiáng)于2009NS1，可能與2009NS1缺失PL結(jié)構(gòu)域有關(guān)。
　　 應(yīng)用TAP親和純化技術(shù)獲得TAPNS1蛋白與其相互作用蛋白的復(fù)合物，通過Western blot檢測(cè)NS1相互作用蛋白Nucleolin，GST Pull Down技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了NS1蛋白與